《Journal of Hazardous Materials》：Innovative dual-oxidase nanozyme sensor array for rapid detection of tetracyclines in animal-derived foods
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四环素类抗生素（TCs）残留检测面临复杂基质和快速检测的挑战，本研究开发了一种基于MnO?/ZnNC纳米酶的双通道颜色传感器阵列。通过氧化酶和漆酶的协同作用，生成独特的化学指纹实现TCs的区分与定量，检测限达0.2242 μM，准确率100%，适用于鸡、鱼、虾等实际样品。
Xin Li|Ling Jiang|Tanzeel Riaz Ahmad|Jie Jin|Jiping Chen|Xiupei Yang
中国西华师范大学化学与化学工程学院，中国南充637009
摘要
四环素类抗生素（TCs）是一类广谱抗菌剂，经常在动物源性食品中被检测到残留，对食品安全构成重大风险。长期摄入TC残留可能导致抗菌素耐药性、引发过敏反应并造成直接毒性，从而危害人体健康。传统的检测方法在分析食品中的复杂TC污染物时面临挑战，需要一种高通量的策略来进行区分和检测。本文构建了一种具有双氧化酶活性的MnO?/ZnNC纳米酶比色传感器阵列，通过将MnO?与金属有机框架（MOF）衍生物（ZnNC）结合，实现了对四种TC（四环素、土霉素、氯四环素和多西环素）的区分和灵敏检测。利用氧化酶和漆酶的活性，该双通道阵列为每种分析物生成独特的化学指纹。该传感器阵列能够区分不同的四环素，并在1-200μM的线性范围内定量TC，检测限为0.2242μM。对于其他三种抗生素也具有类似的定量能力。在实际样品中，盲样识别和区分的准确率为100%，回收率为90.3%-104.5%。这项工作为复杂系统中的TC识别提供了一种策略，并有助于基于纳米酶的比色传感器阵列的设计。
引言
四环素类抗生素（TCs），包括四环素（TC）、土霉素（OTC）、氯四环素（CTC）和多西环素（DOX），是由放线菌产生的广谱抗菌药物[1]。它们被广泛用于人类/动物医学和动物饲料[2]、[3]，但由于难以降解，在食物链中积累成为持久性污染物，通过诱导抗菌素耐药性、过敏反应和直接毒性威胁环境和人类健康[4]、[5]、[6]。因此，建立一种方便、环保且灵敏的TC检测方法对于确保食品安全和保护人类健康至关重要。
目前，TC的检测主要依赖于传统的仪器分析技术，如高效液相色谱（HPLC）[7]、电化学方法[8]、毛细管电泳（CE）[9]和高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）[10]。尽管这些方法对TC具有高灵敏度和选择性，但其固有的局限性——包括复杂的样品预处理、操作繁琐、成本高昂和检测时间较长——严重阻碍了它们在快速现场检测中的应用。为了克服这些局限性，比色分析因其简单性和快速响应而受到广泛关注[11]。例如，Li等人设计了一种氨基功能化的基于金属有机框架（MOF）的装置，用于TC的快速即时检测（POCT）[12]；Dou等人构建了一种高熵金属有机框架（HE-MOF），用于TC的视觉定性检测[13]；Zhao等人开发了一种Cu-Zn“一体化”模拟酶传感器，用于实际水-食品样品中TC的视觉和选择性分析[14]。虽然这些比色方法缓解了传统技术的局限性，但大多数方法采用“锁钥”模型，只能检测一种抗生素。因此，它们不适合同时检测复杂污染基质中的多种TC。因此，迫切需要开发一种简单、同时且多响应的TC识别策略。
为了实现多种TC的同时检测，受电子舌启发的交叉响应传感器阵列已被开发出来[13]、[14]。与“锁钥”模式不同，这种传感器阵列可以同时检测和区分结构相似的目标物质。它具有高通量、高准确性和强抗干扰能力[15]、[16]的优势。通过数据分析和处理（如线性判别分析（LDA）和层次聚类分析（HCA）[17]、[18]，可以实现目标分析物的识别。迄今为止，已经设计了多种用于识别环境污染物的比色传感器阵列。例如，Yu等人提出了一种由六种螯合物组成的协调比色阵列，用于识别重金属离子[19]；Chu等人构建了一种基于纳米酶材料的三通道比色传感器阵列，成功区分了七种抗氧化剂[20]；Kumar等人制备了一种金属纳米粒子改性的碳纳米管纳米酶，成功用于农药识别[21]。TC的核心结构是氢化苯甲酰苯，主要区别在于连接在母环上的取代基[22]。因此，设计一种能够同时识别TC的传感器阵列是可行的。
纳米酶——具有天然酶模拟活性的纳米材料——因其高稳定性、低成本和环境友好性而受到广泛研究[23]。它们是天然酶的实际替代品，在污染物检测中具有广泛的应用前景[24]。因此，纳米酶是构建传感器阵列的潜在候选者[25]。最近，基于金属的纳米酶（如金属纳米颗粒和金属氧化物）由于其优异的物理化学性质而迅速发展[26]、[27]。特别是，金属氧化物纳米材料的催化性能可以根据需求进行调节，表面修饰是一种有前景的改性策略[28]。这些优势使这些纳米材料在环境检测、癌症治疗和食品监测中找到了显著的应用[29]。不幸的是，关于金属氧化物在比色传感器阵列中应用的报道相对较少。因此，构建具有多酶活性的金属氧化物纳米酶可以为传感器阵列的设计提供新的思路。
在这项工作中，原位合成了复合纳米酶MnO?/ZnNC。MOF衍生物ZnNC通过改善电子转移和增加比表面积增强了纳米酶的催化活性。利用MnO?/ZnNC的氧化酶和漆酶活性作为传感单元，设计了一种用于TC识别和定量的比色传感器阵列。具体来说，MnO?/ZnNC具有双氧化酶活性，将3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）和2,4-二氯酚（2,4-DP）氧化，生成双通道单元的独特信号。TC的添加显著抑制了纳米酶的活性，支持了识别原理（图1 Ⅰ）。双氧化酶活性提供了多维信号，为每种分析物生成独特的化学指纹，以减少重叠并避免假阳性。它能够在不同浓度下成功识别四种TC并对其进行定量。使用全球广泛消费的鸡肉、鱼肉和虾作为代表，该传感器在这些样品中实现了TC的识别和定量，具有实际应用潜力（图1 Ⅱ）。这项研究为复杂基质中的TC检测提供了一种新方法，并为比色传感器阵列的设计提供了参考。
材料与试剂
乙酸锌二水合物（Zn(Ac)?·2H?O，99%），2-甲基咪唑（2-MI，98%），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，≥99%），3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB，98%），过氧化氢（H?O?，30wt.%），土霉素（OTC，98%），盐酸氯四环素（CTC，AR），盐酸多西环素（DOX，≥98%），三氯乙酸（TCA，99%），抗坏血酸（AA，≥99.9%），L-组氨酸（L-His，99%），L-赖氨酸（L-Lys），L-酪氨酸（L-Tyr）以及其他类型的抗生素（60μM环丙沙星（CIP）
MnO?/ZnNC的合成与表征
MnO?/ZnNC纳米酶是通过KMnO?的原位还原在金属衍生物ZnNC上生长MnO?而合成的，如图1A所示。扫描电子显微镜（SEM）图像显示ZnNC呈现不均匀的二维层状结构，而单独的二氧化锰则呈现粗糙的球形表面。最终的复合材料显示ZnNC层状结构，其表面生长有MnO?微球，证明了MnO?的原位生长（图1B-D）。
结论
本研究开发了一种MnO?/ZnNC复合纳米酶，其中金属氧化物原位生长在MOF衍生物上，并基于其双氧化酶活性设计了双通道比色传感器阵列，用于TC的识别和定量。借助线性判别分析和层次聚类分析等机器学习技术，该传感器阵列能够实现四种TC（即TC、OTC、DOX和CTC）的单独定量和识别。
环境影响
抗生素以其强大的抗感染特性而广泛用于兽医医学和疾病预防。特别是四环素类抗生素（TCs）经常在动物源性食品中被检测到，对人类健康构成直接风险，引起了越来越多的国际关注。本研究开发了一种基于纳米酶的比色传感器阵列，用于识别复杂的四环素残留。它成功区分和定量了四种类型的TC。
CRediT作者贡献声明
Jie Jin：写作 – 审稿与编辑，验证，方法学，研究。Xiupei Yang：写作 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念化。Ling Jiang：验证，方法学，研究。Tanzeel Riaz Ahmad：验证，方法学，研究。Jiping Chen：写作 – 审稿与编辑，验证，概念化。Xin Li：验证，方法学，研究，概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（22276150）、四川省自然科学基金（2023NSFSC0023）和中国西华师范大学创新团队基金（KCXTD2022-2）的财政支持。
