《Advanced Science》：Ultrasound Controlled-Release Hydrogel Promotes Diabetic Wound Healing via Neuroimmune Modulation and Synergistic ROS Scavenging
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本研究构建了一种超声控释水凝胶（MCF@CA），该体系通过整合靶向纳米颗粒（MCF NPs），实现了降钙素基因相关肽（CGRP）介导的神经免疫调节与锰卟啉（MnP）活性氧（ROS）清除功能的协同。该系统在超声触发下可按需释放药物，叶酸（FA）靶向策略延长了纳米粒在创面的滞留时间。体外体内实验证实，MCF@CA能有效清除ROS、改善成纤维细胞功能、促进巨噬细胞向M2抗炎表型极化，并通过上调RAMP-1受体增强CGRP的神经免疫调节作用，最终在糖尿病小鼠模型中加速创面愈合，促进胶原沉积和血管新生。本研究为糖尿病创面治疗提供了一个兼具可控释放与协同治疗潜力的新型平台。
1 引言
糖尿病创面（DW）是糖尿病的常见并发症，其高发病率和致残率使其成为全球公共卫生挑战。创面愈合是一个涉及炎症、增殖和重塑三个阶段的动态过程，需要神经、血管、免疫细胞和组织细胞等多种元素的密切协调。然而，在糖尿病状态下，高血糖及其引发的继发问题（如血供不足、感染）使创面处于复杂的病理生理状态，包括过量的活性氧（ROS）积累、周围神经病变、微循环障碍、免疫失调和成纤维细胞功能障碍。
免疫系统，特别是巨噬细胞，在组织修复中扮演关键角色。以往的研究和生物材料设计多集中于直接干预巨噬细胞，但疗效有限。近年研究表明，糖尿病创面中的多种有害因素并非独立存在，而是存在复杂的相互作用。当前治疗的一个主要缺陷是直接靶向巨噬细胞，却忽视了其上游调节因子的异常。糖尿病周围神经病变（DPN）被认为是糖尿病创面最重要的风险因素。最新研究揭示了周围神经通过神经肽在创面修复中的关键免疫调节作用。特别是，发表在《自然》杂志上的一项研究阐明了降钙素基因相关肽（CGRP）介导的神经免疫通讯对创面愈合的影响。在愈合过程中，CGRP通过调节巨噬细胞表型和上调关键下游效应分子血小板反应蛋白-1（TSP-1），促进创面从炎症期向抗炎修复期过渡。然而，在糖尿病创面中，感觉神经损伤导致CGRP分泌减少，削弱了其对巨噬细胞的免疫调节作用，使创面陷入持续的炎症状态。同时，糖尿病创面中的氧化应激环境会下调巨噬细胞膜上调节CGRP功能的关键共受体——受体活性修饰蛋白1（RAMP-1）的表达，进一步损害了这种神经-免疫相互作用。
因此，理想的治疗策略应考虑上游调节因子——周围神经对创面免疫的影响。然而，糖尿病周围神经病变的发病机制复杂，目前尚无可靠的疗法获得FDA批准。因此，采用神经替代策略，直接递送因神经病变而缺乏的CGRP，是一种更高效的治疗方法。但受限于糖尿病创面的高蛋白酶环境和肽类药物半衰期短的特性，游离的CGRP在进入创面后迅速降解。此外，CGRP的免疫调节作用依赖于低剂量、长期的作用。因此，需要一种能够控制药物释放速率的系统，以解决CGRP快速降解的问题。超声波因其无创、穿透力强、可控性高等优点，成为一种理想的药物释放触发方式。钙交联的海藻酸钠水凝胶可在超声波作用下降解。与被动扩散或环境响应释放的水凝胶系统相比，这种水凝胶具有更优的可控性，允许根据不同的临床需求定制释放策略，是控释给药的理想通用平台。
除了免疫失调，氧化应激是阻碍糖尿病创面愈合的另一主要因素。过量的ROS会导致巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等功能障碍，阻碍胶原沉积、血管新生和上皮化等过程。另一方面，ROS会诱导CGRP受体RAMP-1的下调，抑制神经免疫通讯的调节作用。因此，清除ROS是糖尿病创面治疗中不可或缺的方法。锰卟啉（MnP）具有优异的过氧化氢酶（CAT）样和超氧化物歧化酶（SOD）样活性，但其疏水性限制了其在创面治疗中的应用。将CGRP与MnP共价连接形成两亲性分子，可构建自组装纳米颗粒，改善MnP在水溶液中的分散性。
此外，创面治疗研究多采用局部递送系统，但这些研究很少利用主动靶向策略。然而，在糖尿病创面中，非靶向药物递送系统仍可能面临脱靶问题。除了巨噬细胞，成纤维细胞等多种细胞也表达CGRP受体，CGRP对这些细胞的生物学效应尚未完全明了；非靶向递送策略可能给治疗带来不确定性。利用促炎M1巨噬细胞上高表达的叶酸受体，叶酸（FA）靶向可增强药物递送效率并避免潜在的脱靶效应。
综上所述，本研究旨在构建一个协同治疗平台，将上述多功能整合到一个单一的靶向系统中，以增强局部作用并最小化全身效应。我们设计了一种可控释放的药物递送系统。将具有ROS清除能力的MnP与具有免疫调节能力的CGRP通过酰胺化反应共价连接，形成两亲性分子（MC）。随后，MC与FA修饰的DSPE-PEG共组装形成靶向纳米颗粒MCF。将MCF NPs包封于超声控释的钙交联海藻酸钠水凝胶中，构建了集成神经免疫调节和ROS清除功能的MCF@CA系统，用于促进糖尿病创面愈合。
2 结果与讨论
2.1 MCF@CA的合成与表征
为实现上述治疗策略，我们合成了锰卟啉偶联的CGRP前药，并制备了超声响应水凝胶系统。首先，通过螯合反应合成MnP。紫外-可见分光光度法和荧光法证实了MnP的成功合成。随后，通过酰胺化反应将MnP共价连接到CGRP上，形成两亲性分子MnP-CGRP（MC）。质谱分析证实了连接的成功。采用乙醇注入法制备MC与DSPE-PEG2K-FA的自组装纳米颗粒MCF。动态光散射显示MCF NPs的平均流体动力学直径为48.56 ± 3.67 nm，平均Zeta电位为32.62 ± 0.68 mV，表明分散性良好。透射电子显微镜显示MCF NPs的粒径为23.50 ± 4.92 nm。能量色散谱证实了MCF NPs中锰和硫元素的存在。
为实现足够的交联强度，使用3%海藻酸钠和60 mM钙盐作为交联浓度。将MCF NPs分散于预溶解的海藻酸钠溶液中，加入钙盐作为交联剂形成MCF@CA水凝胶。为获得适合创面应用的凝胶时间，研究了使用不同溶解度的CaCl2、CaSO4和CaCO3三种钙盐的凝胶时间。硫酸钙悬液与海藻酸钠溶液混合后在五分钟内形成水凝胶。这是由于硫酸钙溶解度低，可缓慢释放Ca2+离子到藻酸盐溶液中。此特性赋予水凝胶在钙离子供体和藻酸盐溶液初始混合阶段具有可注射性。扫描电子显微镜观察显示，随着超声功率的增加，水凝胶表面的交联网络逐渐被破坏。药物释放实验证实，MCF@CA可通过改变超声功率来控制MCF NPs的释放速率，释放速率随超声功率的增加而增加，验证了MCF@CA水凝胶根据治疗需求调节药物释放速度的潜力。
2.2 叶酸改善MCF NPs的药代动力学
接下来，我们以LPS极化的RAW 264.7细胞为模型，研究M1巨噬细胞对纳米颗粒的摄取，特别是靶向分子叶酸（FA）的作用。流式细胞术显示，M1巨噬细胞对MCF NPs的摄取在孵育4小时内迅速增加，并在12小时达到饱和。相反，当使用DSPE-PEG2K代替DSPE-PEG2K-FA时，摄取显著减少。为确认FA在增强摄取中的作用，预先用高浓度游离FA阻断叶酸受体，流式细胞术证实游离FA预处理也减少了摄取。共聚焦显微镜进一步验证了这些结果。与不含FA的组相比，孵育含有靶向分子DSPE-PEG2K-FA的NPs的细胞在12小时后显示出更高的细胞内荧光强度，表明纳米颗粒积累更多。这些发现证明FA增强了M1巨噬细胞对MCF NPs的摄取。
研究表明，CGRP在糖尿病创面中的免疫调节功效依赖于持续作用而非短期大剂量递送。因此，我们使用Leprdb/db小鼠研究从水凝胶释放的MCF NPs能否在创面保留足够长的时间。体内成像系统追踪显示，在给药后12小时，MCF NPs的保留与无FA的非靶向NPs无显著差异。然而，在48小时，接受无FA NPs的组荧光强度下降了一半。相比之下，含有FA的MCF NPs即使在72小时仍保持较高的荧光强度。此证据表明FA显著增加了MCF NPs在糖尿病创面中的保留时间，这有利于增强CGRP的免疫调节作用。这也表明单次药物释放可提供长达3天的有效治疗，可能避免临床中频繁的超声应用和敷料更换。
2.3 MCF@CA清除ROS并促进成纤维细胞增殖和迁移
高葡萄糖诱导的细胞氧化应激等因素导致了炎症微环境。具体而言，高葡萄糖会失调细胞内多个葡萄糖代谢途径，导致超氧阴离子（O2•?）和过氧化氢（H2O2）的过量产生。这些物质在特定条件下可进一步产生更具破坏性的物质，如羟基自由基（·OH）和单线态氧（1O2）。因此，我们将MnP纳入MCF NPs，利用其SOD样和CAT样活性清除细胞内ROS，逆转细胞氧化应激状态。体外实验证实，即使在与CGRP共价连接并自组装成NPs后，MnP仍保留了类似天然超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的功能，能够催化分解O2•?和H2O2。此外，我们检测了MCF NPs从H2O2分解中产生氧气的能力。溶解氧水平随着MCF NP浓度的增加和反应时间的延长而逐渐增加，证实了良好的CAT样活性。产生的氧气可改善细胞内缺氧，有助于创面愈合。
随后，我们建立细胞模型验证MCF@CA水凝胶清除细胞内ROS的能力。使用H2O2构建细胞模型，并通过ROS探针DCFH-DA评估细胞内ROS水平。H2O2处理后，巨噬细胞和成纤维细胞均显示出强烈的绿色荧光，表明细胞内ROS水平升高。单独的超声处理或单独的CGRP无法清除细胞内ROS。然而，与经MCF@CA条件培养基孵育12小时后，RAW 264.7和RS1细胞中的ROS水平均显著降低。值得注意的是，MCF@CA显示出比游离MnP更好的ROS清除效果。这可能是因为疏水的游离MnP通过π-π堆积自发聚集成颗粒，而在MCF@CA中，MnP与CGRP共价连接并自组装成NPs，改善了MCF NPs在水中的分散性，从而提高了ROS清除效率。
成纤维细胞是创面闭合和重塑的关键参与者。氧化应激诱导的成纤维细胞功能障碍是阻碍糖尿病创面愈合的关键因素。在证实MCF@CA清除成纤维细胞中ROS的能力后，我们进一步评估了其对成纤维细胞增殖和迁移的影响。CCK-8实验显示，用游离MnP或MCF@CA条件培养基处理的RS1细胞与PBS处理的细胞相比，增殖能力恢复。然而，由于游离MnP的分散性比MCF NPs差，其ROS清除能力低于MCF@CA。同时，由于海藻酸钠水凝胶自然降解缓慢，而超声促进其降解，因此释放更多MCF NPs的MCF@CA + 超声（US）组，与未超声组相比，表现出最佳的ROS清除能力。这进一步证实了MCF@CA在超声控制下改变药物释放速度的能力。随后，通过划痕实验研究了MCF@CA的ROS清除功能是否影响成纤维细胞的迁移能力。用PBS处理的成纤维细胞迁移非常缓慢，36小时后伤口闭合率仍低于40%。用游离MnP或未应用超声的MCF@CA处理的组，迁移速度有所增加。相比之下，用MCF@CA和超声处理的成纤维细胞迁移更快，在36小时内实现完全伤口闭合。
总之，MCF@CA具有SOD样和CAT样活性，赋予其ROS清除能力，可消除高葡萄糖诱导的细胞内氧化应激。更重要的是，MCF@CA通过清除ROS改善成纤维细胞增殖和迁移，有利于糖尿病创面愈合。
2.4 MCF@CA在体外促进巨噬细胞表型转换
巨噬细胞表型转换是创面愈合过程中从炎症期向修复期过渡的关键驱动因素。然而，在糖尿病创面中，这种极化过程受到上游调节因子缺乏、高葡萄糖、灌注不良和氧化应激等因素的破坏，这些因素共同导致细胞内代谢异常，使得糖尿病创面持续炎症，并损害内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的促愈合功能。因此，促进M1巨噬细胞向M2表型极化是糖尿病创面的重要治疗策略。我们分离小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs），用脂多糖（LPS）诱导其分化为M1巨噬细胞，用H2O2处理模拟氧化应激，并用白细胞介素-4（IL-4）诱导M2极化作为对照，以研究MCF@CA对巨噬细胞的调节作用。使用CD86（M1标志物）和CD206（M2标志物）区分表型。流式细胞术结果显示，单独的超声、游离CGRP或游离MnP对巨噬细胞表型的调节作用较弱。虽然CD86+细胞百分比有所下降，但仍高于60%。相反，用游离CGRP或游离MnP处理增加了CD206+细胞的百分比，但仍低于50%。这表明单独的CGRP递送或ROS清除均可将巨噬细胞调节向抗炎表型。此外，未超声控制释放的水凝胶组由于MCF NPs释放不足，对巨噬细胞表型的调节也不充分。相比之下，与其他组相比，用MCF@CA条件培养基孵育的巨噬细胞，其CD86+ M1表型细胞百分比显著降低，CD206+ M2表型细胞百分比显著增加，表明有效促进了抗炎表型。应注意的是，含有非靶向颗粒（MC@CA）的水凝胶和MCF@CA对巨噬细胞的调节作用相似。这是因为表型调节过程需要药物连续作用于细胞48小时，远超过细胞摄取MCF NPs达到饱和的时间（12小时）。因此，无论靶向与否，细胞内纳米颗粒浓度均已达到有效水平。
在巨噬细胞表型调节实验中，我们发现用MCF@CA条件培养基孵育的巨噬细胞比单独用游离CGRP或游离MnP处理的巨噬细胞显示出更低的M1和更高的M2比率。我们推测MnP的ROS清除功能增强了CGRP对巨噬细胞的调节作用。具体而言，先前研究表明，CGRP的共受体RAMP-1的表达水平调节CGRP的生物学效应。此外，氧化应激会下调RAMP-1表达。因此，我们假设MCF@CA通过清除巨噬细胞内的ROS，上调RAMP-1，从而放大CGRP的生物学效应。蛋白质印迹分析验证了这一假设。与未处理的对照组相比，H2O2处理显著下调了巨噬细胞中RAMP-1的表达。相反，游离MnP、MC@CA或MCF@CA上调了RAMP-1表达，其中MCF@CA效果最显著。因此，我们提出MCF@CA通过清除ROS和上调巨噬细胞上RAMP-1表达来放大CGRP的生物学效应。
细胞因子是巨噬细胞发挥免疫调节功能的重要载体。过量分泌促炎细胞因子使创面处于持续炎症状态，阻止其进入增殖期；而抗炎细胞因子有助于调节创面免疫微环境并促进愈合。因此，我们使用酶联免疫吸附试验评估MCF@CA对巨噬细胞分泌生物活性分子的影响。用LPS诱导巨噬细胞M1极化并用H2O2刺激模拟高葡萄糖诱导的氧化应激后，巨噬细胞分泌大量促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6，而几乎不表达抗炎细胞因子IL-10。单独的超声处理部分降低了促炎细胞因子的分泌，增加了抗炎细胞因子IL-10的分泌，与前述巨噬细胞表型变化一致，表明超声可将巨噬细胞调节向抗炎表型，但效果有限，不足以达到治疗效果。用游离MnP或CGRP处理导致细胞因子分泌比超声组更明显的变化，表明ROS清除和CGRP单独均可对巨噬细胞产生一定的免疫调节作用。相比之下，与其他组相比，MCF@CA联合超声处理导致促炎细胞因子分泌最少，抗炎细胞因子IL-10分泌最多，与巨噬细胞表型转变结果一致。此外，我们检测了血小板反应蛋白-1（TSP-1），这是一种由巨噬细胞分泌的细胞外基质成分，被确定为介导CGRP对巨噬细胞免疫调节作用的关键效应分子，通过自分泌和旁分泌机制发挥抗炎作用。超声、游离MnP或游离CGRP处理在一定程度上增加了巨噬细胞对TSP-1的分泌，表明这些干预措施上调了CGRP-RAMP-1-TSP-1信号通路。与其他组相比，MCF@CA + US处理显著增加了TSP-1的分泌，表明ROS清除和CGRP的协同作用实现了最佳的神经免疫调节效果。此外，我们推测此效应可能是剂量依赖性的，因为接受非靶向纳米颗粒（MC@CA+US）和未超声控释的MCF@CA的组比MCF@CA + US组分泌的TSP-1少，表明细胞摄取的纳米颗粒剂量影响其生物学效应。上述证据证实了MCF@CA对巨噬细胞的免疫调节作用。值得注意的是，巨噬细胞分泌的促血管生成因子VEGF-A也增加了，表明MCF@CA可能通过CGRP介导的巨噬细胞免疫调节在创面发挥神经-免疫-血管调节作用，这与其他组织愈合的研究发现一致。
2.5 MCF@CA作用于巨噬细胞的潜在机制
为探索MCF@CA对巨噬细胞免疫调节作用的潜在机制，我们使用RNA测序比较了MCF@CA处理的M1巨噬细胞与对照组的信使RNA差异。主成分分析显示MCF@CA组和对照组之间存在显著的整体转录差异。火山图显示了差异表达基因。MCF@CA处理导致943个差异表达基因，其中480个上调，463个下调。热图显示了这943个基因的表达模式。
京都基因与基因组百科全书通路富集分析用于解释受这些差异表达基因调控的细胞信号通路。MCF@CA处理上调了巨噬细胞中与AMPK信号通路相关的基因。文献报道AMPK激活是抑制巨噬细胞介导的炎症的关键机制。我们还观察到过氧化物酶体相关基因的上调，这可能与巨噬细胞内氧化应激状态的改善有关。相反，MCF@CA下调了参与多种促炎通路的基因转录，包括NOD样受体、NF-κB、TNF和趋化因子信号通路。NF-κB被认为是介导巨噬细胞免疫反应的关键通路。NF-κB对于NOD样受体家族pyrin域包含3的转录是必需的，随后其被各种刺激激活，最终导致IL-1β释放。此外，趋化因子信号通路与促进巨噬细胞向促炎表型极化有关。这些通路的下调有利于抑制巨噬细胞介导的炎症，进一步证明了MCF@CA通过巨噬细胞发挥抗炎作用的能力。
随后，我们使用qPCR验证了这些通路中几个关键基因的表达变化。结果显示，与PBS对照组相比，MCF@CA + US治疗组的巨噬细胞中NFKB1（核心促炎转录因子）的mRNA表达水平显著下调。其关键下游效应分子TNF-α（参与TNF通路）和IL-1β（参与NOD样受体通路）的表达也显著下调。同时，趋化因子CCL2的表达显著降低。这些结果一致表明，MCF处理有效抑制了巨噬细胞中NF-κB信号通路的激活。这种抑制不仅发生在转录枢纽（NFKB1）水平，而且直接导致下游炎症介质（TNF-α, IL-1β）和免疫细胞招募因子（CCL2）表达的全面减少。这些发现在分子水平上提示了MCF@CA发挥抗炎作用的机制：通过关闭巨噬细胞中NF-κB依赖的炎症反应程序，可能将其重编程为低炎症反应状态。这一结论与RNA-seq分析和细胞因子分泌变化高度一致。
2.6 MCF@CA促进糖尿病小鼠创面愈合
在体外验证MCF@CA的ROS清除和免疫调节能力后，我们利用糖尿病小鼠（Leprdb/db）建立糖尿病创面模型，以评估MCF@CA在体内促进糖尿病创面愈合的能力。在8-10周龄糖尿病小鼠背部制作全层创面（直径6 mm），小鼠随机分为7组。小鼠在创面后第1、4、7天接受治疗，并在第10天处死进行病理分析。用注射器挤出MCF@CA水凝胶覆盖创面后，使用超声理疗设备触发水凝胶降解。在创面后前4天，除MC@CA和MCF@CA + US组外，其他组均未显示出显著的促进愈合趋势。这表明CGRP介导的神经免疫调节结合ROS清除比单独使用游离CGRP或ROS清除具有更强的促愈合作用，验证了前述关于其协同机制的推断。在后期观察期，虽然其他组创面有不同程度的愈合，但MCF@CA + US组表现出更高的创面闭合率，达到PBS组的两倍，并且部分创面完全闭合。此外，MCF@CA显示出比负载非靶向纳米颗粒的水凝胶（MC@CA）更好的治疗效果，验证了我们之前的推断，即FA靶向增强了细胞摄取并延长了纳米颗粒在创面的滞留时间，从而提高了疗效。另一个有趣的发现是，接受MCF@CA水凝胶但未应用超声的组，其创面闭合率显著低于超声触发释放组，证实超声是控制纳米颗粒释放的关键因素。
随后，我们使用组织化学染色和免疫荧光研究MCF@CA增强糖尿病创面愈合的机制。创面横切面的H&E染色显示，用PBS或单独超声处理的创面完全开放，暴露深层结缔组织。用游离CGRP、MnP或未超声的MCF@CA处理的创面有不同程度的肉芽组织覆盖，但未完全闭合。相比之下，用MC@CA或MCF@CA联合超声处理的创面完全愈合，MCF@CA + US组显示完整的皮肤覆盖。Masson三色染色评估了胶原沉积，这是皮肤再生的关键因素。由于创面完全破裂，PBS组和单独超声组无法评估。与其他组相比，MCF@CA + US组愈合后胶原沉积明显更多，有利于修复。
随后，免疫荧光进一步探讨了愈合过程中的免疫调节和血管生成。我们使用红色荧光标记M1巨噬细胞表面标志物CD86，绿色荧光标记M2巨噬细胞表面标志物CD206。量化CD206+与CD86+细胞的比率以评估创面的免疫状态。用PBS、超声、游离CGRP或游离MnP处理的创面含有丰富的促炎M1巨噬细胞。相比之下，用MC@CA或MCF@CA处理的创面，肉芽组织内的巨噬细胞表型发生逆转，主要呈现抗炎M2表型。这表明CGRP与ROS清除协同实现了更好的神经免疫调节。值得注意的是，与非靶向纳米颗粒组（MC@CA）相比，MCF@CA + US组的M2巨噬细胞比例更高，进一步证明FA靶向延长MCF NP在创面的滞留时间有利于愈合。接下来，我们使用免疫荧光标记血管标志物CD31和α-SMA，研究MCF@CA对创面血管生成的影响。MCF@CA + US处理后，血管内皮标志物CD31的表达显著增加，荧光面积增加至PBS组的300%以上，并观察到明显的管状结构，表明肉芽组织中血管新生增强。这与前述体外实验中观察到的巨噬细胞分泌促血管生成因子VEGF-A增加的趋势一致，表明MCF@CA通过免疫调节增强了巨噬细胞介导的促血管生成作用。值得注意的是，α-SMA（标记血管平滑肌细胞）染色显示，MCF@CA + US组中有大量平滑肌覆盖的血管，超过PBS组的30倍。这表明MCF@CA不仅增加了糖尿病小鼠创面的毛细血管密度，而且促进了具有更先进结构（如小动脉或小静脉）的较大血管的形成，这有利于进一步逆转糖尿病创面的低血管状态。
总之，MCF@CA联合超声在动物模型中有效促进了糖尿病创面愈合。具体而言，它提高了创面闭合率并增加了胶原沉积。免疫荧光证实MCF@CA促进巨噬细胞向抗炎表型极化，同时增加血管密度并促进形成较大的、有平滑肌覆盖的血管。这些发现与我们体外观察到的改善成纤维细胞功能、调节巨噬细胞表型以及改变炎症和促血管生成细胞因子的结果一致，进一步证实了MCF@CA通过ROS清除和免疫调节促进糖尿病创面愈合的机制。
2.7 MCF@CA的生物相容性评价
创面敷料需要足够的安全性以实现临床转化。因此，我们在体外和体内评估了MCF@CA的生物相容性。首先，使用RAW264.7细胞和人脐静脉内皮细胞评估MCF NPs和MCF@CA的细胞毒性。CCK-8实验显示，随着药物浓度增加，HUVEC活力未显著降低。即使在10 μg/mL浓度下，MCF NPs和MCF@CA的细胞活力均保持在80%以上，该浓度远高于MCF NPs的有效治疗浓度（100 ng/mL），表明良好的生物相容性。随后我们在糖尿病小鼠中验证了MCF@CA的安全性。体重监测显示治疗期间各组无显著差异。溶血实验证实100 μg/mL的MCF NPs或MCF@CA未引起显著溶血。治疗结束后主要器官的组织病理学检查显示，所有组小鼠肝脏细胞内均有脂肪空泡。这归因于自发性脂肪肝，是糖尿病小鼠固有代谢异常的结果。除此之外，治疗组内脏器官的组织学结构未见其他异常。这些实验证明了M
