《Advanced Science》：Single-Cell Mitochondrial Lineage Tracing Decodes Fate Decision and Spatial Clonal Architecture in Human Hematopoietic Organoids
单细胞线粒体谱系示踪解码人造血类器官命运决定与空间克隆结构
引言
追溯单个细胞的后代对于理解胚胎发育、干细胞分化和疾病进展过程中的细胞分裂动态和命运决定至关重要。前瞻性谱系追踪系统已被广泛应用于研究胚胎发生、造血、神经发育和癌症生物学。将遗传条形码与单细胞转录组学相结合，能够同时实现谱系重建和状态表征。然而，包括条形码同塑性、多样性受限和检测灵敏度在内的技术局限性，影响了谱系分辨率和准确性。当前的合成条形码系统，如Lineage And RNA RecoverY（LARRY），面临着固有的权衡：虽然通过表达的DNA标签能够实现高通量的克隆追踪，但也会产生诸如虚假多祖细胞标记等假象。此外，依赖多位点遗传修饰有扰乱天然细胞行为的风险。这些局限性凸显了对非侵入性、高保真谱系记录器的未满足需求。
回顾性谱系追踪，利用内源性体细胞突变，通过消除人工操作提供了一个引人注目的替代方案。线粒体DNA（mtDNA）突变由于其高突变率、异质性分离以及与单细胞测定的兼容性而具有特别优势。线粒体变异富集（MAESTER）和识别算法（MQuad）的最新进展使得能够进行大规模的精确谱系追踪。然而，线粒体变异作为谱系追踪标记来表征细胞状态的空间排列和表型转换的有效性尚未被探索。
空间转录组学极大地增强了我们对健康和病变组织中发育层次、细胞可塑性和多样化组织微环境的理解。组织的正常功能依赖于细胞间复杂的相互作用，从而创造出复杂且动态的细胞生态系统。本研究利用来自单细胞RNA测序（scRNA-seq）的自然发生的线粒体体细胞突变，作为人胚胎造血类器官（HEMO）中谱系追踪的内源性遗传条形码。通过将这种方法与合成条形码相结合，我们重建了胚胎组织发育并描绘了早期细胞命运选择。此外，将线粒体克隆追踪与空间转录组学相结合，揭示了来自共同祖细胞的造血细胞及其支持性生态位细胞在卵黄囊样组织内的协调出现。
结果
2.1 谱系追踪揭示造血类器官中不同的早期命运选择和轨迹
在干细胞造血中的一个重大挑战在于将祖细胞内的分子变异与其产生成熟细胞类型的能力联系起来。在本研究中，我们采用表达的DNA条形码随时间推移克隆性地追踪转录组，并将此方法应用于研究HEMO中的造血克隆动力学。我们在HEMO造血发生的早期阶段（第4天，D4）捕获了多样化的细胞群体，包括内胚层、多能干细胞样（PSC-like）、具有外胚层规范的多能干细胞（PSC-Ect）、滋养层样细胞（TB-like）、中胚层原条/心脏（Mes-PS）、中胚层样细胞（Mes-like）、内皮细胞（EC）和成纤维细胞（Fibro）。这表明我们的HEMO重现了关键发育过程，即多能细胞转变为三个不同的胚层（外胚层、中胚层、内胚层）和特化谱系。
CoSpar分析揭示了LARRY条形码克隆中不同的细胞命运。在分析的LARRY克隆中，42%（360个克隆）是谱系特异性的，包括内胚层、PSC-like、Mes-PS、PSC-Ect、TB-like和Fibro谱系。这些单谱系克隆在UMAP嵌入中空间局限于 distinct 区域，表明它们表现出 distinct 的谱系承诺和分化潜能。值得注意的是，相当大比例的LARRY克隆跨越多个谱系，在UMAP嵌入中显示出不同的空间分布，证明了其祖细胞的多能性，并揭示了朝向特定命运组合的固有偏向。
我们的谱系耦合分析确定了非随机的相互作用。Mes-like与EC和Fibro谱系表现出最强的耦合。一致地，RNA velocity捕获的基因表达动力学揭示了在早期HEMO中朝向每个谱系的显著方向性流动。重建的 velocity 场描绘了主要谱系的命运决定。Mes-like衍生物显示出朝向EC规范的强烈主要偏向。此外，Mes-PS群体显示出朝向Fibro谱系的主要分化趋势。伪时间排序将Mes-like谱系定位在分化连续体中的一个祖细胞状态，该状态最终获得成熟的EC身份。
我们接下来通过实验验证了我们的计算分析预测的PDGFRα+间充质祖细胞的分化轨迹。为此，我们在第2天通过流式细胞术分离了PDGFRα+细胞，并在第4天和第8天进行了时间进程免疫荧光分析，使用成纤维细胞（α-SMA）和内皮细胞（CD31）的标记物追踪其命运。这种方法揭示了一个清晰的谱系规范时间序列。在第4天，我们容易识别出α-SMA+成纤维细胞，而CD31+内皮细胞几乎不存在。相比之下，到第8天，在间充质祖细胞池中出现了一个 distinct 的CD31+内皮细胞群体。我们的活细胞成像进一步捕获了间充质祖细胞向成纤维细胞和内皮细胞的双向分化。成纤维细胞随后是内皮细胞的顺序出现提供了与RNA velocity和伪时间预测一致的实验证据；这些数据共同将Mes-like谱系描绘为一个向成熟内皮细胞身份进展的祖细胞状态。
2.2 基因模块动力学解码命运决定的层次路线图
为了超越静态关联并重建支撑HEMO中细胞命运规范的动态调控逻辑，我们采用了cell2fate框架。该框架将转录组解构为一系列共调控的基因表达模块，这些模块的顺序激活和抑制定义了从祖细胞到成熟谱系的连续轨迹。与标准聚类不同，这些模块代表了具有推断动力学的核心转录程序，提供了分化过程的机制性视图。
系统的初始状态由模块0定义，该模块在所有早期细胞类型中普遍活跃。这个模块以标记基因FAM117B和INTS6的高表达为特征，并由转录因子ZNF608和JUND驱动，指示了一个原始的、增殖性的和代谢活跃的基础，所有后续谱系都由此产生。功能富集分析证实了这一基础性作用，显示了对广泛、基本过程如RNA聚合酶II转录和基因表达的显著富集。
模块1在PSC-Ect群体中被特异性激活。这个状态的特征是残余表达初始多能性标记如ESRG和ZNF483，以及早期谱系启动因子包括FOXD3-AS1和ONECUT1。这种分子特征，加上其对前后模式规范的强烈富集，表明PSC-Ect状态代表了一个谱系启动但未承诺的祖细胞，准备响应早期胚胎模式线索，同时保留广泛的发育潜能，而不是一个明确指定的外胚层谱系。
模块3在Mes-PS和一个 distinct 的多能（PSC-like）群体中变得特异性活跃。这个模块以标记基因CNTN5和NTF3为特征，并受转录因子NKX1-2和CDX1调控。功能富集分析显示模块3主要由广泛的转录调控程序主导，包括DNA模板转录的调控，以及器官特异性发育术语，如肾脏发育和内胚层细胞命运承诺。值得注意的是，对TFAP2家族调控的富集进一步强调了其与多能性的关联。
随后，模块4表达变得仅限于PSC-like群体，失去了Mes-PS活性。这种转变以基因PXDNL和GSTA3的表达为标志，在IRX1和NPAS3的调控控制下，表明多能状态的细化，可能朝向更特化或瞬时的祖细胞身份。这种细化状态独特地以双重功能特征为标志：对多能干细胞的转录调控的富集，与对脂肪细胞分化的特异性富集相结合，暗示了朝向中胚层基质命运的偏向潜能。
分化的后期阶段由谱系特异性模块的激活驱动。模块6与TB-like细胞独特相关，由标记SCGN和IGFBP3定义，并受因子L3MBTL4和IKZF2控制。模块8的激活特异性预示了内胚层规范，由经典标记HNF4A以及CDH12的表达证明，并由关键的内胚层调控转录因子FOXP2和HNF1B指导。
进一步的谱系多样化以模块10的激活为标志，该模块驱动了Fibro身份的出现。这个状态以基因PRDM6和RAMP2以及转录因子ZNF83和SNAI2为特征，后者暗示了在上皮-间质转化中的潜在作用。同时，模块11的激活指定了Mes-like细胞，以PRRX1和HGF表达为标志，并受调控因子HOXC6和TBX4调控。引人注目的是，模块11由一套精确的器官发生术语的高度显著富集所定义，包括那些控制心脏右心室形态发生和主动脉瓣发育的术语。这个特征表明Mes-like群体拥有广泛的器官生成转录程序，是多能中央祖细胞的特征，而不是局限于单一谱系。
最后，EC命运的获取由模块12推动，该模块由G0S2和SLC18A1的表达定义，并由转录因子MECOM和HOXA9 orchestrated。在机制上，模块12的作用不是由通用的内皮标记阐明，而是由其顶部富集平滑肌细胞分化和髓样细胞分化调控所阐明，暗示了一个涉及具有双重平滑肌和造血特征的过渡祖细胞状态的分化过程。与这种造血潜能模型一致，模块13在成熟EC的一个子集中特异性高表达，并显示与髓样细胞分化和造血相关的基因集显著富集。这些分子特征与在造血内皮中报道的一致，将这个EC子集定位为模块12推断的双向潜力的功能实现。
2.3 克隆扩增和受限命运潜能表征晚期类器官成熟
在第8天，HEMO转变为发育更先进和稳定的状态，以 clearly segregated 的谱系区室和新型祖细胞群的出现为特征，包括红系-髓系祖细胞（EMP）和心脏中胚层样细胞（CM-like）。D8 LARRY数据集的分析显示，73%的克隆（1026/1391）是单细胞克隆。排除这些单例后，剩余的1578个细胞聚集到347个克隆中，表明随着造血进展克隆多样性减少。值得注意的是，晚期HEMO表现出显著的克隆扩增：最大的克隆包含29个细胞——是早期阶段观察到的最大值的两倍——并且10%的克隆（38/347）超过10个细胞，与早期时间点相比显著增加。这种转变表明在后期发育阶段特定克隆的稳定化和主导。
谱系耦合分析显示，与D4相比，广泛的非随机相互作用显著减少，反映了增强的谱系限制和特化。尽管存在这种整体分离，EC和Fibro谱系之间的强耦合持续存在，重申了朝向血管和基质命运的分化路径——这是多能间充质祖细胞活动的标志。值得注意的是，在EMP和EC谱系之间检测到中等但 distinct 的克隆耦合。这种相互作用暗示了内皮和红系-髓系谱系之间的发育亲缘关系或共享祖细胞轨迹，支持了HEMO模型中造血内皮样活性或血管关联的EMP子集起源的观点。
RNA velocity分析进一步证实了这些发现，显示了朝向明确终末谱系的精细化和显著的定向流动。重建的 velocity 场说明命运决定的成熟：EC谱系表现出更高的成熟度和结构形成。与其在D4时强烈的EC规范偏向相反，到D8时，Mes-like群体已 largely shifted 其分化轨迹，只有一小部分细胞保留贡献给Fibro谱系的潜能。同时，PSC-Ect谱系显示出 committed 流向朝向外胚层命运。这支持了早期的多能或双向状态在D8时已 resolved 为更受限的身份的解释。伪时间轨迹将EC定位为晚期群体，与其表型成熟为功能性EC一致。总之，这些结果表明D8代表了HEMO内谱系分辨率和结构成熟度增加的阶段。
2.4 线粒体变异调用流程的基准测试确立了用于可靠克隆推断的MQuad
在早期阶段（D4），我们的LARRY分析揭示了双细胞克隆的高频率（58%）。虽然这部分反映了最近分裂的姐妹细胞之间的转录相似性，但我们试图确定观察到的命运组合是否具有生物学意义。我们发现双细胞命运对的分布是非随机的。值得注意的是，最常见的跨谱系对是Mes-like+EC和Mes-like+Fibro。这种特定组合指示了一个基本的发育分叉。
为此，我们整合了mtDNA突变作为自然发生的、内源性的体细胞标记，用于谱系追踪验证。mtDNA突变在细胞分裂过程中随机积累并克隆遗传，使其成为验证基于合成条形码的克隆分组的理想正交标记。与工程条形码不同，mtDNA变异不受病毒整合偏向引起的同塑性影响，并提供独立的克隆记录。我们实施了MAESTER方案深入研究mtDNA以解析克隆子结构，允许在不增加实验负担的情况下同时评估转录组和谱系历史。
为了促进基准测试工作，我们生成了三个D8、D15和D18 HEMO的Chromium-MAESTER数据集。我们还纳入了原始MAESTER研究中的一个造血数据集。为了确保准确的克隆性评估，我们最初在四个HEMO数据集中对MQuad和maegatk计算流程进行了基准测试。随后使用两个流程处理所识别的变异和衍生的克隆分配用于评估每个流程的优缺点。
在MQuad流程中，每个数据集中识别的变异数量落在41到44的相似范围内，比较三个类器官数据集。我们在所有三个阶段观察到ΔBIC累积分布的急剧增加，这进一步证明了基于拐点确定截止值的理由，并证实了具有高灵敏度和特异性的已识别线粒体变异的信息性。在造血数据集中识别的变异显著减少（19个变异）；然而，这可能归因于该数据集的大小明显小于其他三个。我们通过独特的条形码组合定义了3、5、4和4个克隆，并分别在D8、D15和D18 HEMO以及造血数据集中重建了谱系。
对于maegatk流程，使用建议的最小3 UMI reads参数，选择具有任何已识别变异的等位基因频率（VAF）大于1%的细胞，并子集化用于后续克隆分配步骤。所选细胞的变异等位基因频率和已识别的变异应用于R包clValid。使用内部验证方法，应用诸如连通性、Dunn指数和轮廓宽度等指标进行验证。在所有四个数据集中，层次聚类方法使用欧几里得距离度量被建议为最佳方法，这是使用factoextra R包中的eclust函数实现的。应用ward.D聚类方法以实现簇间最小方差。为了辅助可视化，每个簇的分支在树状图中以不同颜色高亮显示，并可以在简化的树状图中轻松解释。在每个数据集中识别的克隆簇数量变化很大。
评估两个流程的主要问题仍然在于它们各自识别信息性mtDNA变异的能力，这对于有意义的谱系推断和生物学解释的下游克隆重建分析将是有用的。当比较两个流程为每个数据集识别的mtDNA变异列表时，maegatk流程识别的变异数量显著更高。然而，两个流程都识别的重叠或交叉变异很少。这在理解每个流程用作输入的原始测序数据完全相同时很有趣，但产生的结果却高度不同。
构建缩放VAF值的热图以可视化已识别变异与克隆结构之间的关系。在使用MQuad流程分配的克隆中，观察到少量但显著数量的变异对某些克隆簇高度特异。在maegatk识别的克隆的相对分散的热图中没有观察到这一点。这一初步结果与使用seriation R包生成的热图高度吻合，该热图直观地表示了从每个流程的缩放VAF矩阵计算的欧几里得距离矩阵。这表明maegatk识别的克隆在使用已识别变异的VAF值提供的信息方面没有显示出克隆簇之间的清晰区分。
为了定量评估使用两个流程的线粒体信息性变异识别的克隆簇，应用Davies-Bouldin's（DB）指数分析每个流程使用信息性变异识别的簇。观察到DB指数的最小值表明强聚类，这在MQuad推断的克隆簇中观察到。从maegatk变异推断的克隆簇导出的DB指数值通常是MQuad克隆中的两倍多。对通过mtDNA单核苷酸变异识别的克隆簇进行簇验证的结果表明，使用MQuad流程发现的变异比maegatk更具信息性。因此，本研究使用MQuad流程进行变异调用和克隆推断。
2.5 正交线粒体追踪验证并改进HEMO中的克隆动力学
为了解决LARRY基于克隆追踪中潜在的技术假象，我们将LARRY条形码与使用MAESTER富集的线粒体变异分析相结合，生成LARRY-MAESTER文库。从D4和D8 HEMO LARRY-MAESTER文库中，MQuad分别识别出35和29个高置信度mtDNA变异。mtDNA变异在不同细胞类型间的不均匀分布暗示了区分克隆性的潜力。为了全面捕捉早期阶段（D4）的细胞相关性，我们利用所有mtDNA变异进行克隆分配，基于独特的线粒体条形码组合和谱系重建识别出三个克隆。值得注意的是，mtDNA变异6321G>A、6322G>C、6233A>C和6234G>A表现出高VAF并明显标记了Clone A0，而另一个mtDNA变异7402C>T具有高VAF，特异性识别了Clone A2。有趣的是，Clone_A0中的大多数细胞以mtDNA变异6321G>A为特征，Clone_A1主要表现出mtDNA变异6699G>A，而Clone_A2主要由mtDNA变异7402C>A区分。邻域分析揭示了强的克隆内连接性，突出了线粒体变异准确描绘稳健克隆身份的能力。
比较分析揭示了由LARRY条形码定义的克隆身份与由内源性线粒体变异解析的克隆身份之间存在 striking 的不一致（52%）。在多谱系LARRY克隆中，208个克隆（41.9%）由共享相同线粒体变异的细胞组成，为多能祖细胞起源提供了有力证据。相反，289个多谱系LARRY克隆（58.1%）包含多于一个线粒体克隆，表明它们是LARRY条形码同塑性导致的假阳性。在细胞水平上，只有31.4%的细胞可以基于一致的线粒体证据自信地分配给多能祖细胞；其余被认为是技术假象。说明这种差异的是，LARRY克隆17（包含PSC-Ect、TB-like和Mes-like细胞）和661（包含Mes-like、EC和Fibro细胞）各自包含三个不同的线粒体亚克隆。这种反复出现的“一对多”关系强调了两个关键局限性：合成定义的克隆内普遍存在的遗传异质性和LARRY系统中条形码同塑性的高频率。单个LARRY克隆内细胞中存在不同的mtDNA变异谱证实了此类群体不是单克隆的，而是代表了生物学上独立克隆的聚合体。鉴于我们的批量RNA分析中干细胞祖细胞和晚期（D18）HEMO之间线粒体变异的高度保守性，我们得出结论，观察到的不一致主要反映了LARRY系统的内在技术噪音，而不是生物学变异。
值得注意的是，48%一致克隆内的细胞在UMAP图中表现出更明显的细胞类型边界，突出了通过将内源性mtDNA标记与外源性条形码整合实现的增强分辨率。CoSpar分析进一步揭示了这些一致克隆内明确的细胞命运。当包含线粒体变异时，单谱系克隆的比例增加，而多谱系克隆的多样性减少，与仅使用LARRY的克隆相比。对于单谱系克隆，无论使用线粒体变异还是LARRY条形码，在UMAP嵌入中观察到一致的空间分布。例如，属于PSC-Ect谱系的LARRY Clone 259特异性地与线粒体Clone_A2对齐，而代表Fibro谱系的LARRY Clone 312也专门映射到线粒体Clone_A2。
相比之下，跨越PSC-Ect和TB-like谱系的LARRY Clone 515一致地与线粒体Clone_A1相关联，揭示了其双向潜能。类似地，包含PSC-Ect、Fibro和内胚层谱系的LARRY Clone 581一致地与线粒体Clone_A1相关联，突出了其在HEMO发育过程中的多能性。这些结果表明，线粒体变异不仅改进了克隆分类，而且为控制类器官发育中谱系承诺和多谱系潜能的潜在机制提供了见解。
有趣的是，在一致克隆中，我们一致观察到Mes-like与Fibro以及Mes-like与EC的细胞命运之间的耦合，进一步证明了朝向血管和基质命运的分化路径——这是多能间充质祖细胞活动的标志。统计上，与LARRY条形码细胞群体相比，线粒体变异显著增加了具有个体细胞命运的细胞比例。
线粒体细化的LARRY克隆重现了与仅LARRY克隆相似的RNA velocity场。重要的是，这种精细化的方法描绘了跨主要HEMO谱系的更清晰的命运决定模式，在Fibro谱系中改进尤为显著。通过基于似然的计算筛选，我们识别了控制谱系转换的推定驱动基因。整合转录爆发动力学、velocity向量和表达动力学的相平面分析揭示了特定的调控程序：ZEB2通过渐进激活介导了Mes-like祖细胞（蓝色）向成熟EC（灰色）的终末分化。这种分叉结构指示了造血规范过程中的早期谱系分离。
在D8 HEMO中，使用线粒体变异的克隆分辨为我们的结论提供了有力支持，即系统已达到谱系分化和结构成熟的稳定阶段。EC–Fibro耦合的持续性——连同出现的EMP–EC相互作用和其他谱系之间的清晰分离——强调了间充质和内皮祖细胞在促进造血和基质串扰中的持续贡献，即使系统向区室化进展。
2.6 空间mtDNA克隆图谱揭示类器官中生态位驱动的命运模式
为了验证MAESTER-MQuad算法在空间背景下进行准确可靠克隆追踪的能力，我们首先使用软骨肉瘤样本进行了空间MAESTER实验。在富集Visium文库中的线粒体转录组后，MQuad在Visium-MAESTER数据集中识别出24个信息性线粒体变异。利用这些信息性变异，我们将1344个软骨肉瘤细胞分配到16个克隆中。值得注意的是，我们观察到线粒体变异10310A>G有效地区分了两个主要克隆：Clone 5和Clone 11。Clone 11表现出10310A>G的高等位基因频率，而Clone 5在该位置未显示任何变异。
当我们检查组织克隆关系时，我们观察到Clone 5主要分布在组织学切片的左侧，对应于肿瘤邻近的正常区域。相反，Clone 11主要分布在组织学切片的右侧，代表肿瘤性肿瘤区域。这表明线粒体变异10310A>G在癌症进展过程中积累。我们的Visium-MAESTER流程是一种强大的方法，用于在空间上区分正常克隆与肿瘤性肿瘤克隆，这为癌症进展中的细胞状态转换提供了有价值的见解。
此外，我们利用spatialDE以非线性和非参数方式识别显著依赖于空间坐标的基因表达。与我们的MQuad结果一致，spatialDE将线粒体变异10310A>G识别为一个显著特征，表明10310A>G的表达显著依赖于其空间位置。基于这些发现，我们得出结论，MAESTER后由MQuad识别的线粒体变异对于克隆追踪具有信息性，并且它们的表达与其空间位置显著相关。因此，我们的Visium-MAESTER流程中使用线粒体变异建立的克隆性有效解析了克隆的空间结构。
鉴于这一验证，我们应用空间转录组学结合线粒体变异来剖析D15 HEMO中造血和生态位细胞的空间克隆结构。我们从10x Visium全长cDNA中富集了线粒体转录本，并使用MQuad识别的信息性mtDNA变异剖析了它们的克隆结构。在所有五个HEMO中，我们总共识别出22个信息性mtDNA变异。在这些变异中，我们发现大多数信息性变异是C>T或T>G转换。使用vireoSNP，我们基于这些信息性变异一致地识别出三个不同的克隆。值得注意的是，变异数量有从Clone 1到clone 2再到Clone 0增加的趋势，暗示了三个克隆之间的发育轨迹。特征变异1868G>A、1906G>A和3219G>A主要与Clone 0相关，而2507A>T主要在Clone 1和2中观察到。相比之下，与Clone 0和2相比，Clone 1显示的变异数量显著更低。通过将mtDNA变异映射到空间位置，我们观察到Clone 0主要位于类器官的边缘，而Clone 2在所有五个HEMO样本中被Clone 1包围。
为了严格评估空间模式，我们对所有五个HEMO重复进行了定量空间分析。对组织边界距离的分析揭示了克隆之间可重现的位置偏向。Clone 0最靠近边界（140.02 ± 75.87像素），表明外周倾向。相比之下，Clone 2显示出最强的中心倾向，在3/5 HEMO中被分类为最“中心”的克隆（离边界最远），在仅1/5 HEMO中被分类为“外周”。Clone 1表现出中间的平均边界距离，通常占据外周Clone 0和中心Clone 2域之间的空间生态位。与这种空间组织一致，从质心径向距离的测量证实了Clone 0的外周定位，其显示出最大的平均径向距离（423.74 ± 192.91像素）。Clone 1和2显示出逐渐减小的径向距离（323.38 ± 99.63和350.17 ± 136.91像素），支持它们更中心的定位。此外，空间自相关分析（Moran's I）证明了所有三个克隆在每个重复中均显著聚类（Moran's I, p< 0.001），证实它们的分布是非随机的。
使用SpatialDE，我们发现1872T>A的表达显著依赖于空间坐标。有趣的是，克隆性和线粒体变异的整合空间图谱显示，1872T>A的高表达空间区域与Clone 0和Clone 2良好对齐，表明线粒体变异对于剖析我们类器官中的空间结构具有信息性。
我们进一步基于mtDNA信息聚合和分析每个空间点的细胞类型组成，揭示在所有HEMO中，Clone 0和2比Clone 1表现出更大的细胞多样性。由于HEMO #2的组织切片中存在大的空泡化区域，并且在HEMO #3和#4中观察到细胞多样性显著减少，这些样本被认为不足以准确代表晚期HEMO的细胞分化特征。因此，我们选择HEMO #1和#5来研究晚期HEMO的谱系分化和潜在机制。在HEMO #5中，Clone 1以卵黄囊内胚层（YSE）和Fibro的优势为特征，Mes-like祖细胞活性极低。这表明早期偏向于基质和胚外分化，可能反映了生态位支持作用。主要围绕HEMO #5的Clone 2，具有高Fibro组成的Clone 1被定位在基质生态位内的支持作用。Fibro可能提供结构支持或分泌信号调节邻近克隆。PSC-like细胞的存在暗示了保留的多能性或自我更新能力，而低TB-like和缺失的造血红系细胞（Ery）和红系-髓系祖细胞（EMP）谱系表明在HEMO #5中Clone 1的滋养层或血液谱系启动有限。
Clone 2标志着一个过渡阶段，Mes-like祖细胞复苏 alongside TB-like细胞的急剧增加。居住在HEMO核心，Clone 2平衡了Mes-like（23.1%）祖细胞与TB-like（22.7%）和YSE（26.8%）细胞，以及罕见的造血祖细胞（HPC）（1.95%）。这个中心生态位可能充当一个发育十字路口，间充质祖细胞（Mes-like）瞬时重新激活造血潜能（HPC），同时向周边区域播种滋养层（TB-like）和YSE谱系。中心位置与“信号枢纽”角色一致，协调HEMO #5中周围克隆的分化线索。
显著定位于HEMO #5的右下边缘，Clone 0以TB-like（21.1%）和YSE（21.5%）细胞的优势为特征， alongside 残留的Mes-like（15.0%）和PSC-like（11.4%）群体，暗示了在胚外边界形成中的作用。其外周位置与TB-like和YSE谱系一致，这些谱系通常划定组织界面或营养交换区域。边缘PSC-like细胞的持续性暗示了在动态边界处用于组织维持或修复的“干性库”。
类似地，HEMO #1中心克隆（Clone 2）始终占据动态的、过渡性的生态位，以混合的Mes-like和谱系启动群体（EMP）为标志。这将其定位为一个分化枢纽，指导谱系限制性输出（巨核细胞/红系谱系），而不是保留多能造血潜能。相反，外周克隆（Clone 0）富含基质（Fibro）、胚外（YSE和TB-like）或生态位支持谱系。它缺乏PSC-like细胞，表明其生态位作用侧重于结构支持而不是多能性保留。在HEMO #1和#5中，出现了一个共享的层次结构：基质/胚外偏向的克隆（Clone 1）定位于下部/边缘区域，而过渡克隆（两者中的中心Clone 2）桥接祖细胞状态和谱系输出。值得注意的是，TB-like和YSE谱系显示出空间极化，在两者中主导外周生态位，可能反映了在边界形成或营养交换中的保守作用。边缘PSC-like细胞的持续存在和核心中HPC或TB-like潜能的重新激活进一步暗示了跨空间分区生态位的干性维持和谱系承诺之间的普遍张力。这些模式突出了一个反复出现的逻辑：克隆空间分离为干性允许的边缘和分化活跃的核心，由微环境线索 orchestrated。
2.7 NOTCH信号通过基质-祖细胞串扰协调HEMO中的空间谱系转换
为了阐明类器官发育过程中这种空间谱系转换的分子机制，我们在上述HEMO #1和#5中的目标谱系中进行了配体-受体（LR）相互作用分析。CellPhoneDB揭示了在HEMO #5的Clone 1中，Fibro和YSE之间NOTCH配体和受体的高相互作用得分。在HEMO #5的Clone 2中，Mes-like和EMP之间也发现了高相互作用得分。对NOTCH信号在发育造血中的关键作用感兴趣，我们基于配体-受体相互作用的组合量化了NOTCH信号的激活和抑制。在HEMO #5中，YSE表达Delta样非经典Notch配体1（DLK1），而Fibro在Clone 1的同一空间区域表达Notch受体1（NOTCH1）。类似地，EMP表达DLK1，而Mes-like在Clone 2的同一空间区域表达NOTCH1。DLK1通过抑制增殖和分化来调节造血祖细胞池。免疫荧光染色证实了这个生态位的空间组织，突出了NOTCH信号在人类胚胎类器官模型中克隆结构和生态位调控中的关键作用。
为了超越相关性并确立观察到的NOTCH信号网络的因果作用，我们使用γ-分泌酶抑制剂DAPT功能性地扰动了NOTCH切割。HEMO用DAPT处理，并在关键发育时间点（第12天）进行分析， alongside 未处理的对照。流式细胞术分析显示，NOTCH信号的药理学抑制显著改变了发育中造血群体的组成。具体而言，DAPT处理诱导了CD34+CD45?、CD34+CD45+、CD34+CD43
