难以测量微小的生物：小型两栖动物体温测量中的误差及避免方法

《Journal of Thermal Biology》：Hard to measure Lilliputians: Error in the measurement of body temperature of small amphibians and a method to avoid it

体温测量误差在小型两栖动物中的研究，提出改良镊子法以减少环境热传递和操作干扰，结果显示该方法在15-35℃下均能显著降低体温波动（最大误差减少82%），裸手操作误差达5.2℃（p<0.01），戴手套误差2.3℃（p<0.05），新方法误差<0.5℃。

　　

乔治亚·K·科斯马拉（Georgia K. Kosmala）|埃诺雷·A·马索尼（Enore A. Massoni）|丹尼斯·O·V·德安德拉德（Denis O.V. de Andrade）

圣保罗州立大学朱利奥·德梅斯基塔菲略分校（Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho）——生物科学研究所，生物多样性系——里奥克拉鲁，圣保罗州（Rio Claro, SP）

摘要

准确测量体温（T_b）对于理解变温生物的生理生态学至关重要。然而，在小型两栖动物中，处理过程中的热交换以及测量设备和/或协议的内在限制可能会导致体温测量的较大误差。首先，我们估计了在现场测量小型变温生物体温时常用方法所引入的误差幅度。随后，我们提出了一种新型的低成本固定方法，使用改良的福斯特镊子（Foerster forceps）来减少处理过程中的热传递。为此，我们比较了用裸手或戴手套固定青蛙时其体温的短期变化（< 2分钟）与使用新方法固定时测得的体温变化。所有实验均使用树蛙属物种Dendropsophus nanus进行，其体型小巧非常适合我们的研究目的。我们还在三种环境温度（15°C、25°C和35°C）下重复了实验，以评估温度对测量误差的影响。结果清楚地表明，研究人员的手与小型青蛙之间的热传递会导致体温测量值出现较大偏差，且这些变化发生得非常快（几秒钟内），在较低的环境温度下尤为明显。虽然普遍推荐在测量过程中使用手套，但这种方法确实将体温测量误差降低到了中等程度；然而，本文提出的新型福斯特方法使青蛙的体温变化最小，证明是提高小型变温动物体温测量准确性的更优且可行的替代方案。

引言

方法学的严谨性是生理学研究的基石，确保测量结果真实反映生物现实而非实验条件的干扰。理想情况下，方法学方法应在研究人员能够承受的条件和成本范围内提供可靠的结果（Taylor等人，2021年）。源自Cowles和Bogert（1944年；1946年）对爬行动物的开创性研究，体温（T_b，此处指核心体温）成为任何关注变温脊椎动物生态生理学研究的必要指标。事实上，T_b被广泛认为是影响脊椎动物生理系统功能的最重要因素（Angilletta，2009年）。然而，由于小型物种的脆弱结构和较高的表面积与体积比，导致热交换速率加快，同时增加了固定的难度（例如Seymour和Lee，1974年；Carey，1978年；Stevenson，1985年；Hutchison和Dupré，1992年；Weinstein和Zimmer，2015年），因此准确测量它们的体温面临独特挑战。这一问题在两栖动物中尤为突出，因为它们的体型分布高度偏右，无尾目（anurans）和蝾螈的中位体长估计小于5克（吻臀长SVL小于40毫米），蚓螈（caecilians）的中位体长不超过13克（SVL小于320毫米）（Johnson等人，2023年）。例如，一种原产于巴伊亚州南部的微型无尾目动物目前被公认为世界上最小的脊椎动物（Bola?os等人，2024年），其体型与几种其他类似大小的无尾目动物相当（Toledo等人，2024年）。

小型两栖动物特别容易从外部热源吸收热量（Bakken和Gates，1975年；Zamora-Camacho等人，2014年），包括热电偶、研究人员的手以及其他环境热源（参见Hutchison和Dupré，1992年）。此外，固定过程可能通过引发肌肉反应或应激反应增加代谢产热（Sidell和Moerland，1989年；Block，1994年；Tattersall和Cadena，2010年；Andrade等人，2015年），从而影响体温。因此，采用能够减少潜在偏差的方法并确保测量结果的准确性和可重复性至关重要。传统协议通常建议使用手套以最小化处理过程中的热传递（Walsberg，1986年；Preest和Pough，2003年；Maenaka等人，2023年；Giacometti和Tattersall，2024年），并尽可能快速地进行测量（理想情况下在2-3分钟内完成，Avery，1982年；McCain等人，2014年；Cremer等人，2019年；Taylor等人，2021年；Abigaba等人，2023年）。尽管这两种方法都能减少体温测量的潜在误差，但它们在小型两栖动物上的有效性仍有待验证。

我们提出了一种新的方法来固定小型无尾目两栖动物以进行体温测量。为了评估该方法提供准确结果的有效性，我们将该方法与直接用手操作（裸手或戴手套）的动物测量结果进行了比较。最后，由于热传递受温差驱动，我们还测试了青蛙对体温测量偏差的潜在影响。

研究物种

我们使用Dendropsophus nanus（Boulenger，1889年）进行了研究，这种树蛙分布于南美洲，数量较多（例如Faivovich等人，2005年；Oliveira，2010年；Sousa，2012年；Vaz-Silva等人，2020年；Frost，2024年）。这种新热带树蛙通常在夜间活动，栖息在临时和永久性池塘边缘的植被中（Rossa-Feres和Jim，2001年；Reichle等人，2004年）。我们从……

结果

实验组之间的体重（χ²(8) = 7.66，p = 0.4672）或吻臀长（SVL）（χ²(8) = 10.77，p = 0.2153）没有显著差异（表1）。

我们的固定方法影响了青蛙体温的变化，这种影响的程度取决于实验温度和固定时间（图3，表2），尽管在所有评估的时间点都观察到了显著交互作用（10秒：F_(4,79) = 3.56，p = 0.010；30秒：F_(4,79) = 3.84，p = 0.007；60秒：F

讨论

正如预期的那样，用裸手操作微型青蛙时，体温测量的误差较大，而使用手套或我们提出的新型福斯特方法（Foerster forceps）时误差显著降低。我们的发现无疑归因于在研究人员的手和被操作的青蛙之间插入了低导热性的隔热屏障，或者消除了研究人员手的热源。

作者贡献声明

乔治亚·K·科斯马拉（Georgia K. Kosmala）：撰写——初稿撰写、验证、项目管理、方法学设计、研究实施、资金获取、数据分析、概念构建。丹尼斯·O·V·德安德拉德（Denis O. V. de Andrade）：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调、资金获取、概念构建。埃诺雷·A·马索尼（Enore A. Massoni）：撰写——审稿与编辑、验证、资源协调、方法学设计、研究实施、资金获取

未引用参考文献

Abigaba和Sianangama，2023年。

数据可访问性

数据将存放在圣保罗州研究仓库（S?o Paulo State Research Repository），可通过https://repositorio.unesp.br/workflowitems/147678/view获取。

资金来源

本工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP：项目编号：#2021/10910-0至DVA和#2023/00178-6至GKK）；国家科学技术发展委员会（CNPq：项目编号309534/2023-2至DVA）；以及高等教育人员协调机构（CAPES）的资助（项目编号88887.965757/2024-00至EAM）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

动物采集和实验方案分别获得了Chico Mendes生物多样性保护研究所（许可编号87787-1）和UNESP-Brazil动物使用伦理委员会（CEUA，编号21/2023）的批准。本工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP：项目编号#2021/10910-0至DVA和#2023/00178-6至GKK）；国家科学技术发展委员会（CNPq：项目编号309534/2023-2至DVA）；以及高等教育人员协调机构的资助。