《Cell Death & Disease》：The R451 site is critical for PTPN18 to exert tumor suppressive effects in breast cancer through the negative regulatory interacting protein fibrillarin
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本研究揭示了蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN18通过其R451位点与核仁蛋白纤维蛋白（Fibrillarin, FBL）特异性结合，并去磷酸化FBL的Y313位点，进而促进FBL泛素化降解，负向调控MAPK信号通路、rRNA 2'-O-甲基化和组蛋白H2AQ104甲基化，最终抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡。该发现阐明了PTPN18抑癌作用的新机制，为乳腺癌靶向治疗提供了新靶点。
在全球范围内，乳腺癌依然是女性癌症死亡的主要原因之一，深入探索其发生发展的分子机制对于攻克这一疾病至关重要。蛋白酪氨酸磷酸酶非受体18型（PTPN18）作为一种重要的细胞调节因子，可通过与不同蛋白质相互作用调控多种细胞生命活动。此前的研究表明，PTPN18的高表达有利于乳腺癌患者的总体生存，但其在乳腺癌中发挥抑癌作用的具体分子机制仍有许多未知之处。另一方面，人类rRNA 2'-O-甲基转移酶纤维蛋白（Fibrillarin, FBL）是一种含量丰富、进化上保守的核仁蛋白，在核糖体生物发生的所有主要转录后活动中扮演基础角色，包括前rRNA加工、rRNA修饰和核糖体组装。FBL的过表达有助于肿瘤发生，并与乳腺癌患者的不良预后相关。然而，PTPN18与FBL这两个在乳腺癌中扮演看似相反角色的蛋白质之间是否存在直接的功能联系，此前尚不明确。
为了回答PTPN18如何抑制乳腺癌这一关键科学问题，研究人员开展了一项系统的研究，并最终发现PTPN18能够通过其特定的R451位点与FBL相互作用，进而去磷酸化FBL的Y313位点，影响FBL的稳定性及其下游功能，最终抑制乳腺癌进展。这项重要的研究成果发表在《Cell Death & Disease》期刊上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过免疫共沉淀联合质谱分析（Co-IP/MS）筛选PTPN18的相互作用蛋白；利用点突变和截短体构建结合Co-IP验证蛋白质相互作用的关键位点；采用体外去磷酸化实验、蛋白质稳定性检测（如环己酰亚胺CHX追踪）和泛素化分析来研究PTPN18对FBL磷酸化状态和蛋白水平的调控；通过低dNTP浓度下的逆转录PCR（RTL-P）技术检测rRNA 2'-O-甲基化水平；使用EU掺入RNA合成检测法评估新生RNA合成；通过细胞活力（CCK-8）、集落形成和流式细胞术检测细胞增殖与凋亡；并利用裸鼠皮下移植瘤模型在体内验证相互作用的生物学功能。
PTPN18与FBL存在内源性和外源性相互作用
通过免疫共沉淀联合质谱分析，研究人员从HEK293细胞中筛选出可能与PTPN18相互作用的蛋白质，GO和KEGG富集分析提示PTPN18与RNA加工修饰和核糖体密切相关。随后，Co-IP实验证实PTPN18与FBL能够在HEK293、MCF7和MDA-MB-231细胞中发生内源性及外源性结合。免疫荧光共定位和邻近连接实验（PLA）进一步在空间上证实了PTPN18与FBL的物理接触和相互作用。
R451位点（PTPN18）和V187位点（FBL）主导二者相互作用
通过构建PTPN18的不同截短片段和点突变体，研究发现其C端第451位的精氨酸（R451）是介导与FBL结合的关键位点。另一方面，对FBL的结构域分析表明，其RNP结构域中的保守序列1是结合所必需的，而该序列中的第187位缬氨酸（V187）的突变（V187A）会完全破坏其与PTPN18的结合能力。
R451位点为PTPN18通过Y313位点调控FBL磷酸化所必需
PTPN18过表达可降低FBL的酪氨酸磷酸化水平，而其酶活缺失突变体（C229S）则无此效应。重要的是，不能与FBL结合的PTPN18 R451A突变体也失去了对FBL的去磷酸化能力。通过生物信息学预测和点突变验证，研究确定FBL的第313位酪氨酸（Y313）是PTPN18去磷酸化的主要靶点。
PTPN18（而非PTPN18 R451A）通过促进泛素-蛋白酶体降解降低FBL蛋白水平
基因表达数据库（GEPIA）分析显示PTPN18与FBL表达呈显著负相关。功能实验表明，PTPN18过表达能促进FBL蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解，从而降低其蛋白水平，此过程依赖于PTPN18的酶活性及其与FBL的结合（R451位点）。此外，FBL Y313F突变体（模拟去磷酸化状态）本身具有更高的泛素化水平，提示Y313位点的磷酸化状态影响FBL的泛素化修饰。
PTPN18通过负调控FBL抑制其下游功能
PTPN18过表达可降低FBL介导的rRNA 2'-O-甲基化、组蛋白H2AQ104甲基化以及新生RNA合成，而PTPN18 R451A突变体则无法产生这些抑制效应。Co-IP实验还发现PTPN18过表达会减弱FBL与组蛋白H2A的结合，提示PTPN18可能与H2A竞争性结合FBL。
PTPN18通过相互作用调控乳腺癌细胞增殖与凋亡
细胞功能实验表明，PTPN18能抑制乳腺癌细胞（MCF7, MDA-MB-231）活力、集落形成并促进细胞凋亡，而这些效应在过表达不能相互作用的PTPN18 R451A或FBL V187A突变体时被显著削弱或逆转。裸鼠皮下成瘤实验进一步在体内证实，破坏PTPN18与FBL的相互作用（通过突变R451A或V187A）会促进肿瘤生长并增加肿瘤组织中增殖标志物Ki67的表达。
PTPN18通过FBL调控MAPK信号通路
Western blot结果显示，PTPN18过表达可降低MAPK信号通路关键蛋白（p44/42 MAPK, SAPK/JNK, p38 MAPK）的磷酸化水平，而FBL过表达则起相反作用。当PTPN18与FBL的相互作用被破坏（PTPN18 R451A或FBL V187A）或PTPN18酶活缺失（PTPN18 CS）时，MAPK通路激活增强。相反，FBL Y313F突变则减弱了FBL对MAPK通路的激活作用，表明PTPN18通过去磷酸化FBL Y313位点负调控MAPK信号通路。
本研究揭示了一条全新的、FBL依赖的PTPN18抑癌作用机制。具体而言，PTPN18通过其R451位点与FBL结合，并去磷酸化FBL的Y313位点。去磷酸化的FBL更易发生泛素化并通过蛋白酶体途径降解，导致FBL蛋白水平下降。FBL功能的抑制进而负向调控MAPK信号通路、rRNA 2'-O-甲基化、组蛋白H2AQ104甲基化及RNA合成，最终抑制乳腺癌细胞增殖、促进其凋亡，发挥肿瘤抑制作用。当PTPN18的R451位点发生突变导致其无法与FBL结合时，PTPN18则失去了这条FBL依赖的抑癌通路。该研究不仅阐明了PTPN18在乳腺癌中发挥作用的新机制，完善了PTPN18的蛋白质相互作用网络，也为理解细胞信号转导、揭示疾病机制以及发现新的药物靶点和发展新的治疗策略提供了重要依据。PTPN18通过多种蛋白质翻译后修饰的协同调控，灵活地调节细胞生理功能，展现了生命体应对变化的进化适应性。
