利用三重基因方法（突变CDK4R24C、Cyclin D1和TERT）永生化牛颗粒细胞：一种提升畜牧繁殖技术的新型模型

《Cell Biology International》：Engineering Immortalized Bovine Granulosa Cells Using a Triple-Gene Approach: Mutant CDK4, Cyclin D1, and TERT

本文成功利用慢病毒载体共表达人源突变细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4R24C）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和端粒酶逆转录酶（TERT），建立了具有长期增殖能力的永生化牛颗粒细胞（bGCs-K4DT）。该模型突破了原代bGCs体外增殖受限的瓶颈，为研究富血小板血浆（PRP）等生物活性成分在卵泡活化与生长中的作用提供了稳定、可靠的体外平台，对推动牲畜繁殖技术创新具有重要意义。

　　

摘要

提升牲畜繁殖技术对于提高牛的生产力和遗传潜力至关重要。牛颗粒细胞作为卵巢卵泡的关键组成部分，在雌性繁殖中扮演重要角色，负责产生类固醇激素和生长因子以支持卵母细胞发育。然而，原代牛颗粒细胞在体外增殖能力有限，这限制了大范围研究卵泡发育相关机制的应用。为解决这一局限，本研究尝试通过慢病毒载体共表达人突变细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4^R24C）、细胞周期蛋白D1和端粒酶逆转录酶（TERT）来实现牛颗粒细胞的永生化。所得永生化细胞（bGCs-K4DT）表现出延长的增殖寿命，群体倍增次数超过100次且无衰老迹象。相较于亲本细胞，转导细胞显示出更活跃的细胞周期分布和更高的端粒酶活性。重要的是，这些细胞保留了牛颗粒细胞的特异性标志物——芳香化酶，尽管表达水平有所降低。这种永生化牛颗粒细胞为研究富血小板血浆生物活性成分在卵泡活化和生长中的作用提供了一个有前景的模型，从而支持牲畜繁殖技术的创新。

缩略语

文中使用了一系列缩略语，包括bGC（牛颗粒细胞）、CDK4^R24C（突变细胞周期蛋白依赖性激酶4）、CYP19A1（细胞色素P450家族19亚家族A成员1，即芳香化酶）、E2（雌激素）、EGFP（增强型绿色荧光蛋白）、FSH（促卵泡激素）、K4D（突变CDK4与Cyclin D1组合）、K4DT（突变CDK4、Cyclin D1与TERT组合）、LH（黄体生成素）、P450scc（胆固醇侧链裂解酶）、PD（群体倍增）、pRB（视网膜母细胞瘤蛋白）、PRP（富血小板血浆）、qRT-PCR（定量实时PCR）、SA-β-Gal（衰老相关β-半乳糖苷酶）、SV40（猿猴病毒40）、TERT（端粒酶逆转录酶）、TSC1（结节性硬化症复合体1）、yGC-SV40T（牦牛颗粒细胞系）、??CT（比较CT法）。

1 引言

颗粒细胞是位于雌性哺乳动物卵巢卵泡内的体细胞。它们包裹着发育中的卵母细胞，并在整个卵泡成熟过程中提供结构支持和代谢营养。在促卵泡激素的影响下，颗粒细胞表达芳香化酶，该酶能够将雄激素（由卵泡膜细胞提供）转化为雌激素。排卵后，这些细胞发生黄体化并转化为黄体细胞，合成和分泌孕酮，这对于维持子宫内膜和支持早期妊娠至关重要。在牲畜管理方面，推进繁殖技术对于提高生产力和增强牛的遗传潜力至关重要。该领域一个有前景的创新是富血小板血浆的应用，它已显示出刺激卵巢卵泡活化的潜力，从而增加回收卵母细胞的数量和质量。尽管PRP应用取得了有希望的结果，但仍然缺乏稳健的体外系统来评估其功效并阐明其潜在作用机制。牛颗粒细胞是卵泡发育和激素产生的关键调节因子，在该研究领域不可或缺。与原代细胞培养不同，永生化细胞绕过衰老，使得一致和可扩展的实验成为可能。

最近，K4DT方法（同时表达人突变CDK4^R24C、Cyclin D1和TERT）已被证明能有效赋予多种哺乳动物细胞类型无限的增殖能力。CDK4–Cyclin D1复合物作为一种激酶，磷酸化并失活视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）。在细胞培养应激条件下，CDK抑制剂p16上调并与CDK4–Cyclin D1复合物结合，从而抑制其活性并引发早衰。CDK4的突变形式CDK4^R24C保留与Cyclin D1结合的能力，但抵抗与p16蛋白的结合。因此，CDK4^R24C–Cyclin D1复合物保持活性，磷酸化pRB，并规避早衰的发生。传统的永生化方法，例如用SV40大T抗原转导细胞，通过灭活pRB和p53（后者被称为基因组守护者）发挥作用；这个过程允许细胞耐受由癌基因激活引起的DNA损伤。然而，这些癌基因的表达常常诱导染色体异常，导致SV40永生化的细胞表现出与原始细胞不同的特征。相比之下，K4DT永生化的细胞保留了其原始的细胞特征。K4DT方法的这些进展表明，K4DT永生化的细胞更适合需要遗传稳定性和长期培养的应用。

本研究旨在通过应用K4DT方法建立永生化的牛颗粒细胞。这种bGC-K4DT细胞的产生有望为评估PRP在卵巢卵泡中的活化潜力提供一个新的实用系统。该模型将有助于探索PRP的作用机制，从而为改善牛繁殖管理和整体牲畜生产力做出贡献。

2 材料与方法

2.1 病毒制备

使用包装质粒pCAG-HIVgp和pCMV-VSVG-RSV-Rev（用于慢病毒）以及pCL-HIVgp（Gag和Pol）和pCMV-VSVG（用于逆转录病毒）产生重组病毒。293T细胞与表达载体（如CSII-CMV-CDK4^R24C、CSII-CMV-Cyclin D1、CSII-CMV-TERT、CSII-CMV-EGFP、PQCXIN-SV40或PQCXIN-EGFP）以及相应的包装质粒共转染。转染后两天更换培养基，转染后72小时收集病毒上清，通过PEG6000浓缩病毒颗粒。

2.2 细胞准备与感染

从屠宰场获取的牛卵巢中收集颗粒细胞。分离中型卵泡（5–8毫米）的壁层颗粒细胞。培养4小时后去除未贴壁细胞，只收集贴壁细胞。将原代牛颗粒细胞在包被有CellMatrix的培养板中培养，并使用含聚凝胺的浓缩病毒感染细胞。根据导入的基因，将感染的细胞称为K4D、K4DT、SV40和EGFP细胞。通过EGFP荧光成像验证感染效率。

2.3 PCR和蛋白质印迹分析

从所有细胞类型中提取基因组DNA，使用特异性引物通过PCR检测导入基因。通过蛋白质印迹分析使用特异性一抗（抗CDK4、抗Cyclin D1、抗SV40 T抗原）检测蛋白表达，以α-微管蛋白作为内参。

2.4 细胞分裂

将亲本和转导细胞类型以一定密度接种，在任何一种细胞类型达到汇合时收获并计数。使用公式PD = log?(收集细胞数/接种细胞数)计算群体倍增水平。

2.5 细胞周期和衰老分析

在传代2和13时，通过流式细胞术分析亲本和转导细胞的细胞周期分布。使用商业衰老检测试剂盒评估衰老相关β-半乳糖苷酶活性。

2.6 拉伸PCR检测

使用TeloChaser试剂盒评估端粒酶活性。将每种细胞裂解液产生的端粒酶产物进行扩增，并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

2.7 逆转录和定量RT-PCR

用10 IU/mL人重组FSH或50 μM毛喉素（作为阳性对照）刺激亲本细胞、K4DT细胞和牛成纤维细胞48小时，然后提取总RNA并逆转录成cDNA。使用实时荧光定量PCR扩增和定量芳香化酶（CYP19A1）、P450scc（CYP11A1）、FSH受体、LH受体和GAPDH（作为内参）的表达水平。使用??CT方法计算相对表达量。

2.8 核型分析

用秋水仙素处理K4DT细胞使其停滞在中期，然后收集细胞，低渗处理，固定，滴片，吉姆萨染色。在显微镜下观察并手动计数染色体数目。

2.9 统计分析

使用方差分析评估细胞周期相的效应，然后进行Tukey事后多重比较检验。p值小于0.05被认为具有统计学显著性。

3 结果

3.1 重组慢病毒介导的基因递送

通过评估EGFP表达证实了重组病毒对亲本牛颗粒细胞的高感染效率。慢病毒载体能有效转导牛颗粒细胞，而编码SV40大T抗原或EGFP的逆转录病毒未能成功整合到牛颗粒细胞基因组中。

3.2 转基因及蛋白表达分析

PCR检测证实CDK4和Cyclin D1基因成功整合到K4D细胞中，CDK4、Cyclin D1和hTERT基因成功整合到K4DT细胞中。蛋白质印迹分析显示，转导细胞中CDK4和Cyclin D1蛋白表达水平显著高于亲本细胞。

3.3 细胞周期相分布

与亲本细胞相比，所有转导细胞类型都表现出更快的S期进程和显著更高的G2/M期细胞比例，表明细胞周期从G1期到S期的转变得到促进。

3.4 细胞增殖和衰老评估

亲本牛颗粒细胞的增殖能力有限（群体倍增约15-16次）。三种转导细胞类型（bGC-0921-K4DT、bGC-M2-K4D和bGC-M2-K4DT）的群体倍增次数超过100次，成功实现永生化。bGC-0921-K4D细胞仅增殖至PD68，未能永生化。SA-β-Gal染色显示，亲本细胞和bGC-0921-K4D细胞呈现衰老相关的蓝色染色，而三种永生化细胞类型（PD > 100）未显示衰老迹象。

3.5 端粒酶活性

端粒酶活性检测显示，bGC-0921-K4DT细胞和早期传代的亲本bGC-0921细胞具有较高的端粒酶活性，而bGC-0921-K4D细胞端粒酶活性较弱。bGC-M2-K4DT细胞端粒酶活性最高，与阳性对照HeLa细胞相当。端粒酶活性与细胞增殖能力呈正相关。

3.6 牛颗粒细胞衍生细胞中的基因表达

qRT-PCR分析显示，毛喉素能强烈诱导亲本牛颗粒细胞中芳香化酶（CYP19A1）和P450scc（CYP11A1）的表达，而人重组FSH的诱导作用较弱。K4DT细胞在毛喉素或人重组FSH刺激下，芳香化酶表达水平与经人重组FSH刺激的亲本细胞相当，但显著低于经毛喉素刺激的亲本细胞。K4DT细胞未检测到FSH受体和LH受体的表达。P450scc在K4DT细胞中表达极低。牛成纤维细胞在所有条件下均显示低水平的这些基因表达。

3.7 永生化牛颗粒细胞的核型分布

核型分析表明，约70%的bGC-K4DT细胞（n = 102）保持了正常的二倍体染色体数目（2n = 60），表明建立的细胞具有基因组稳定性。

4 讨论

细胞永生化通常通过插入病毒基因或激活癌基因来实现，使细胞绕过正常的细胞周期检查点。本研究首次成功应用K4DT方法（CDK4^R24C、Cyclin D1和TERT）使牛颗粒细胞永生化。与SV40大T抗原等方法相比，K4DT方法能更好地保持细胞的遗传稳定性和原有特性。

研究发现，慢病毒能有效感染牛颗粒细胞，而逆转录病毒介导的SV40大T抗原转导失败，可能与逆转录病毒整合机制及其对宿主细胞分裂状态的依赖有关。

三种永生化细胞（bGC-0921-K4DT、bGC-M2-K4D、bGC-M2-K4DT）均表现出超越100次群体倍增的长期增殖能力，且无衰老迹象。端粒酶活性是维持端粒长度和无限增殖的关键，bGC-M2-K4D细胞的永生化提示其亲本细胞可能具有更强的内源性端粒酶活性。核型分析证实bGC-K4DT细胞保持了正常的二倍体核型，基因组稳定性高。

功能表征显示，永生化bGC-K4DT细胞保留了芳香化酶的表达，这是颗粒细胞的关键标志物和雌激素合成的限速酶，表明其仍具有一定的类固醇生成潜能。然而，FSH受体、LH受体和P450scc表达的缺失或极低水平，表明这些细胞在永生化过程中可能丢失了部分分化功能，特别是完整的cAMP响应性类固醇生成程序。这可能是由于体外培养环境、永生化过程引起的表观遗传改变或细胞来源的卵泡发育阶段较早所致。未来的研究可通过导入关键转录因子或优化培养条件来尝试恢复其完整的类固醇生成功能。

永生化牛颗粒细胞模型为研究富血小板血浆等生物活性成分在卵泡发育中的作用提供了稳定可靠的平台。相较于已有的其他物种颗粒细胞系，本研究建立的bGC-K4DT细胞具有物种相关性高、基因组稳定、保留关键酶活性等优势，在牛繁殖生物学研究和畜牧业应用方面潜力巨大。

5 结论

本研究通过共表达CDK4^R24C、Cyclin D1和TERT，成功建立了一株K4D永生化（bGC-M2-K4D）和两株K4DT永生化（bGC-0921-K4DT, bGC-M2-K4DT）牛颗粒细胞。而基于SV40大T抗原的传统永生化方法未能成功转导牛颗粒细胞。永生化细胞具有延长的寿命、活跃的细胞周期、较高的端粒酶活性，且无衰老迹象，并保持了正常的核型。尽管永生化细胞保留了芳香化酶表达，但其FSH受体、LH受体和P450scc表达缺失，表明其类固醇生成功能不完整。K4DT方法为难以用SV40方法永生化的物种和细胞类型提供了有效的替代方案。所建立的永生化牛颗粒细胞模型为深入研究牛卵泡生理、评估繁殖技术（如PRP疗法）以及推动牲畜生产力创新提供了有价值的工具。