利用双模板磁性分子印迹聚合物净化技术结合UPLC-MS/MS方法，同时检测猪尿液和肌肉中的33种β2-激动剂

《Microchemical Journal》：Simultaneous determination of 33 β 2-agonists in swine urine and muscle using dual-template magnetic molecularly imprinted polymer clean-up coupled with UPLC-MS/MS

本研究开发了一种双模板磁分子印迹聚合物Dual-T Fe?O?@MIP，用于同时检测猪尿和肌肉组织中33种β?-agonists残留。通过酶解、磁性分离纯化结合UPLC-MS/MS分析，方法展现高灵敏度（LOD 0.010-0.034 μg/kg）、良好精密度（≤9.1%）和高效性（纯化时间<30分钟），显著优于传统SPE方法，为有效监管β?-agonists残留提供了可靠技术。

　　

王世|郑文新|肖志明|索德成|谢建春|李润贤|冯宇超|范霞

中国农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所农产品质量安全国家重点实验室，北京100081，中国

摘要

β₂-激动剂是一类合成苯乙醇胺化合物，对公共健康构成多种风险。在本研究中，开发了一种双模板磁性分子印迹聚合物（Dual-T Fe?O?@MIP）方法，能够同时检测猪尿液和肌肉组织中的33种β₂-激动剂，并初步验证了其在复杂生物基质中的适用性。具体步骤如下：样品经过剪切和匀质化处理后，在55°C的醋酸铵缓冲液中用β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶进行4小时酶解。随后，利用Dual-T Fe₃O₄@MIPs提取酶解产物中的β₂-激动剂，并用酸性甲醇溶液洗脱。目标化合物通过配备HSS T3柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）的UPLC-MS/MS进行定量分析。该方法在尿液和肌肉样品中进一步得到了验证，表现出优异的线性（R² ≥ 0.9944）、高灵敏度（检测限为0.010至0.034 μg/kg，定量限为0.024至0.100 μg/kg）、满意的回收率（82.1%至107%）和良好的精密度（≤9.1%）。与传统需要3小时的固相萃取方法相比，该方法在不到30分钟内完成了纯化过程，显著提高了分析效率。该技术可靠、快速且易于操作，适用于常规分析应用。

引言

β₂-激动剂是一类在氨基末端和芳香环上具有不同取代基的合成苯乙醇胺衍生物。代表性化合物包括克仑特罗（CLB）、雷克托帕明（RCA）、沙丁胺醇（SAL）和苯乙醇胺A（PEA）[1]。33种β₂-激动剂的化学结构见图S1。β₂-激动剂具有显著的营养再分配效应，可促进动物蛋白质沉积、增强牲畜肌肉组织生长并提高饲料转化效率，因此作为促生长饲料添加剂在畜牧业中得到广泛应用[2]。然而，大量研究表明，饲料中过量添加β₂-激动剂可导致动物急性中毒。更严重的是，由于这些物质在动物可食用组织中的积累，β₂-激动剂残留物对公共健康构成严重威胁，如肌肉震颤、头晕、恶心、呕吐、心悸甚至死亡[3]。因此，中国、美国和欧盟等许多国家已禁止在动物饲料中使用β₂-激动剂作为促生长剂[4],[5],[6]。尽管采取了广泛的监管措施来监测和限制其非法使用，但一些制造商仍出于经济利益继续将其添加到牲畜饲料中。这种故意的滥用导致动物源性产品中残留β₂-激动剂，通过受污染的食物对消费者健康构成风险。因此，开发准确、灵敏且快速的β₂-激动剂检测方法对于有效监管至关重要。

在β₂-激动剂残留检测的分析技术方面取得了显著进展。目前，对牲畜生产中禁用β₂-激动剂的监测主要依赖于多目标确认分析方法，包括液相色谱（LC）与多种检测系统的联用，如紫外（UV）[7]、荧光（FL）[8]、质谱（MS）[9]和串联质谱（MS/MS）[10]，以及气相色谱（GC）与串联质谱（MS/MS）[11]。此外，还开发了针对特定β₂-激动剂类别的痕量分析平台，包括比色法[12]、电化学生物传感器[13]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[14]和表面增强拉曼光谱（SERS）[15]。其中，ELISA、SERS和比色法主要用于现场筛查。相比之下，LC与UV或FL联用在类似化学性质的化合物的可靠定性分析方面能力有限。GC和GC–MS/MS方法也因分析高极性和低挥发性化合物需要复杂的衍生化处理而逐渐被取代。因此，LC-MS/MS已成为检测动物尿液和肉类产品中β₂-激动剂残留物的最常用技术，具有较高的准确度、所需的灵敏度和高通量。然而，现有分析方法存在技术局限性。对于复杂基质中的β₂-激动剂分析，基质诱导的离子抑制或增强是影响方法灵敏度、重现性和定量准确性的关键因素[16]。

样品预处理是分析工作流程中的另一个关键决定因素，显著影响β₂-激动剂残留量的准确性和可靠性。现有方法包括多种萃取技术，如液-液萃取（LLE）[17]、免疫亲和色谱（IC）[18]、固相萃取（SPE）[19]和固相微萃取（SPME）[20]。其中，QuEChERS（快速、简便、经济、高效、耐用且安全）是一种专为食品和农业基质中农药和兽药多残留分析开发的现代快速预处理方法[21]。该方法利用功能化吸附剂与基质杂质（如磷脂、色素和蛋白质）之间的相互作用，实现快速高效的杂质去除，从而实现有效的纯化和富集[22]。磁性固相萃取（M-SPE）结合了QuEChERS和SPE的优点，通过分散的萃取-吸附-洗脱过程提高了选择性。通过施加外部磁场，可实现简单的固液分离，克服了传统SPE柱的缺点（如多个预处理步骤和频繁堵塞）。这使得纯化操作更加简单高效[23]。

最近，通过使用不同的超分子化合物和聚合物对磁性纳米粒子进行了表面修饰[24],[25],[26]。其中，基于分子印迹聚合物（MIP）的磁性纳米粒子受到了广泛关注[27]。磁性MIP具有预定义的结构-功能关系和特定的识别能力，其结构中含有多个互补的结合位点，能够选择性识别模板分子，已广泛应用于食品中农药、兽药和霉菌毒素等有害物质的样品预处理[28],[29],[30],[31]。胡等人通过微波加热悬浮聚合技术以雷克托帕明为模板合成了磁性MIP，该方法用于从猪肉和猪肝超声提取物中高效富集雷克托帕明、异索普林和芬诺特罗。结合HPLC-FL检测，该方法显示出优异的检测限（0.52至1.04 ng/mL），为复杂基质中β₂-激动剂的痕量分析提供了可靠的方法[32]。我们研究小组之前开发了一种以4-羟基苯乙醇为伪模板分子的MIP，结合UPLC-MS/MS后，实现了尿液样品中14种β₂-激动剂的有效纯化，回收率在84.2%至109.8%之间[33]。

伪模板技术可以避免传统MIP的模板残留问题，降低模板泄漏风险。双模板策略能够同时识别结构多样的分析物，扩大检测范围并提高目标分子的吸附能力和选择性。L-苯肾上腺素和异丙肾上腺素具有共同的苯乙醇胺骨架结构，这使它们特别适合作为制备MIP的伪模板，从而构建高选择性的激动剂识别系统。这两种化合物的极性分布不同，进一步扩展了检测范围。在本研究中，我们开发了一种双伪模板磁性MIP用于β₂-激动剂的吸附，显示出增强的选择性。该吸附剂成功用于从尿液和肌肉样品中提取微量β₂-激动剂。提取过程包括：(1) 使用Fe₃O₄@MIPs选择性结合目标物质，(2) 磁性分离，(3) 溶剂洗脱以实现最终浓缩和纯化。

我们的目标是开发一种多残留分析方法，利用M-SPE预处理结合UPLC-MS/MS测定猪肌肉和尿液中33种β₂-激动剂的微量水平。通过系统优化预处理条件，确定了目标提取和洗脱的最佳参数。将这种高选择性纯化方法与灵敏的LC-MS/MS检测相结合，实现了β-激动剂的精确定量，证明了其在常规分析中的适用性，并为市场监测提供了可靠的技术支持。

试剂和标准品

β₂-激动剂的色谱标准品包括西布特罗、氯普瑞林、马来特罗盐酸盐、克仑特罗、苯乙醇胺A、齐尔帕特罗盐酸盐、异索普林盐酸盐、沙美特罗二甲酸酯、妥布特罗、苯丁特罗盐酸盐、马普特罗盐酸盐、利托特罗盐酸盐、异丙肾上腺素和克伦尼索普特罗盐酸盐，购自WITEGA Laboratorien（德国柏林）。特布他林硫酸盐、克仑特罗、雷克托帕明、沙丁胺醇硫酸盐……

仪器条件优化

根据欧盟委员会实施条例（EU）2021/808[34]对质谱检测可靠性的要求，在使用低分辨率质谱时，为每种目标化合物选择了1个前体离子和2个产物离子。仪器分析使用AB Sciex QTRAP 6500 LC-MS/MS系统进行，该系统配备电喷雾离子化（ESI）源，工作在正离子模式。对每种化合物的DP和CE进行了优化

结论

本研究开发了一种双伪模板Fe₃O₄@MIP，能够同时从尿液和肌肉组织中纯化33种β₂-激动剂。合成的MIP表现为平均粒径约为500 nm的微孔材料，对β₂-激动剂具有高选择性，选择性系数为1.1–3.1（相对于NIP）。通过优化M-SPE条件和UPLC-MS/MS参数，建立了完整的痕量分析系统

CRediT作者贡献声明

王世：撰写——原始草案、软件、数据管理。郑文新：撰写——审阅与编辑、方法学。肖志明：验证、监督、数据管理。索德成：方法学、形式分析。谢建春：撰写——审阅与编辑、监督。李润贤：软件、方法学、概念构思。冯宇超：可视化、数据管理。范霞：撰写——审阅与编辑、项目管理、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。