《Microchemical Journal》：Metabolite profiling and cross-species differentiation of 8α-tigloyloxyhirsutinolide-13-O-acetate metabolism using molecular networking and multivariate analysis
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建立基于质谱的分子网络（MSMN）分析不同物种代谢差异，揭示狗肝细胞代谢图谱与人类最相似，可替代非啮齿类毒理模型，而小鼠的代谢模式比大鼠更接近人类，适合啮齿类毒理模型。首次全面解析紫背菜素THA的跨物种代谢图谱，提出整合分子网络与多元分析的数据处理流程。
作者：Quinghe Qu、Huijun Liang、Dongli Li、Kin Yip Tam
澳门大学健康科学学院癌症中心，中国澳门塔ipa
摘要
跨物种的药物代谢谱分析为选择非临床物种进行安全性测试提供了关键证据。然而，由于不同物种之间的代谢存在定量和定性差异，尤其是在代谢过程较为复杂的情况下，这仍然是一个重大挑战。8α-虎草酰氧-毛蕊花内酯-13-O-乙酸酯（THA）是一种从Cyanthillium cinereum中分离出的倍半萜内酯，具有显著的抗前列腺癌活性，但其广泛的代谢特性凸显了这一挑战。在这项研究中，我们建立了一种基于质谱的分子网络（MSMN）技术来阐明THA的代谢产物。此外，我们还利用半定量、可视化的代谢物基础分子网络结合多元分析方法，比较了不同物种之间的THA代谢谱差异。THA在五种物种（人类、狗、猴子、大鼠和小鼠）中均经历了广泛的代谢过程，其中狗的代谢产物谱与人类最为相似。鉴于狗的肝细胞代谢产物谱与人类更为接近，狗可以作为非啮齿类动物用于毒理学研究。同时，小鼠的肝细胞代谢产物谱与人类的相似度也高于大鼠，因此小鼠也可以作为安全性测试的啮齿类模型。本研究不仅首次全面揭示了THA的跨物种代谢谱图，还提出了一种数据处理流程，突出了人类和动物肝细胞代谢谱之间的相似性。通过将基于代谢物的分子网络与多元分析相结合，该流程为通过跨物种代谢谱分析选择非临床测试物种提供了有效策略。
引言
Cyanthillium cinereum（L.）H. Rob.（菊科）是一种具有多种治疗特性的传统草药，包括抗癌、抗炎、发汗、健胃、利尿、排石和驱虫作用[1]。它广泛分布于东亚和东南亚地区，尤其是在中国、日本、印度尼西亚和泰国。植物化学研究发现了其中含有的倍半萜类[2]、三萜类[3]和黄酮类[4]成分。THA是从Cyanthillium cinereum中分离出的倍半萜内酯，我们的研究团队评估了其抗前列腺癌活性[5]，发现其对LNCaP和PC-3细胞的抑制浓度分别为3.0±0.7 μM和2.3±0.2 μM。因此，THA作为新的治疗候选物具有研究价值。
像THA这样的新药物候选物属于外源性物质，通常会经历多种生物转化过程，如氧化、还原、水解和结合。这些转化产物可能是无活性的代谢物，也可能是具有治疗作用的活性成分，甚至可能是有毒化合物。FDA鼓励在药物开发过程中尽早识别用于非临床安全性评估的动物与人类之间的药物代谢差异[6]。在首次人体临床试验之前，通常会在体外（使用微粒体或肝细胞）对药物候选物进行代谢谱分析，以根据人类代谢产物与动物物种之间的相似性来选择合适的非临床测试物种[7]。然而，某些候选物的代谢在物种间存在定量和定性差异[7][8]，因此找到代谢谱与人类匹配的动物物种仍然具有挑战性。目前尚未出现有效的选择策略。多元数据分析结合分子网络分析为解决这一问题提供了有希望的方法。
多元数据分析方法，如主成分分析（PCA）、层次聚类分析（HCA）和偏最小二乘法（PLS-DA），涉及对来自多个样本的多个变量数据集的分析[9]。这些方法有助于测量所有变异，对样本进行分类，并发现数据集中不同样本成分之间的相关性[10]。这些技术现已广泛应用于基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等领域[11]。因此，我们认为多元数据分析是区分和比较不同物种代谢谱的强大工具。
分子网络分析能够提供系统层面的整体视图[12]，已成为天然产物分析、非靶向质谱/质谱代谢组学研究以及多组学研究中的常用生物信息学工具[13][14][15][16][17]。最近，基于质谱的分子网络（MSMN）技术被用于简化药物代谢产物的鉴定[18]。非靶向质谱（MS）数据可以根据化合物的结构相似性进行注释，并将其分类为“分子家族”。因此，MSMN被认为是代谢物鉴定的重要工具。此外，我们提出了一种基于代谢物的分子网络（MMN）方法，有助于可视化并区分不同物种之间的代谢谱差异。
据我们所知，THA的代谢途径尚未完全明确。研究不同物种中的THA代谢谱对于支持其开发和安全性评估具有重要意义。本研究提出了一种工作流程，用于探讨THA的跨物种生物转化差异。通过超高效液相色谱-质谱高分辨率质谱仪（UHPLC-QE-HRMS）测定了人类、猴子、狗、大鼠和小鼠肝细胞中的THA代谢产物。利用MSMN作为数据分析流程，通过多元分析评估了人类代谢产物谱与动物物种之间的相似性，并通过MMN进一步进行了可视化，为选择THA的安全性评估模型提供了依据。此外，本研究还证明了所提出工作流程在比较代谢谱方面的有效性和合理性，从而有助于选择合适的非临床测试物种。
实验部分
化学试剂
THA（纯度98%）由我们实验室提取和分离。乙腈和甲酸购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Trypan blue溶液购自Thermos Fisher。冷冻保存的人类、比格犬、CD1小鼠和Sprague-Dawley大鼠肝细胞由BioIVT（美国韦斯特伯里）提供。冷冻保存的猕猴肝细胞由RILD（中国上海）提供。
肝细胞培养
肝细胞（约1×10^6个细胞/毫升）在有无……的条件下进行培养
利用可视化MSMN鉴定THA的代谢产物
M0（THA）的保留时间和产物离子谱与其标准品相同（见图S1–S6）。ESI-MS产生的天然产物碎片反应已在先前报告中进行了全面综述[19]。基于文献中的类似碎片反应和Mass Frontier 8.1提出的路径，图1展示了THA的碎片途径。m/z为403的离子是由于THA质子化离子失去了H2O而形成的。
结论
据我们所知，这是首次报道Cyanthillium cinereum中活性成分THA的代谢产物。通过MSMN技术，我们鉴定了40种代谢产物，表明THA在多种肝细胞物种中经历了广泛的代谢过程，包括脱乙酰化、脱水、去饱和、水合、氧化-还原、葡萄糖醛酸化和谷胱甘肽结合等途径。
此外，我们还提出了一种数据处理流程，有助于……的鉴定
作者贡献声明
Quinghe Qu：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析。
Huijun Liang：验证工作。项目监督、资金申请。
Kin Yip Tam：项目监督。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了广东省教育厅（项目编号：2022ZDJS025）的支持。
