LENG受体样假激酶通过抑制OsCRPK1-OsGF14d模块增强水稻耐冷性机制解析

《Journal of Integrative Plant Biology》：The receptor-like pseudokinase LENG stimulates chilling tolerance in rice by inhibiting the activity of the OsCRPK1-OsGF14d module

语 本研究首次揭示水稻LRR受体样假激酶LENG通过直接结合胞质激酶OsCRPK1，抑制其激酶活性并阻断其与14-3-3蛋白OsGF14d的互作，从而正向调控幼苗耐冷性（图1-5）。启动子与编码区序列分析表明，粳稻等位基因（无3,184 bp结构变异）在低温下快速诱导表达，且蛋白互作强度高于籼稻型，这为耐冷分子育种提供了新靶点（图6-7）。

　　

LENG编码定位于质膜的LRR受体样假激酶

基因功能注释显示，LENG蛋白包含LRRNT_2结构域（第27-68位残基）、3个串联LRR基序（第76-144位残基）以及C端激酶结构域（第357-600位残基）。信号肽和跨膜结构域预测表明，其N端具有信号肽（第1-26位残基），且存在一个跨膜结构域（第281-303位残基），提示LENG为膜定位蛋白（图2A）。系统进化分析显示，LENG与已知参与非生物胁迫响应的RLK同源关系较远，而水稻冷负调控因子CTB4a和拟南芥KOIN均与其亲缘关系较远（图S3），表明LENG可能通过独特机制介导耐冷性。亚细胞定位实验证实LENG-GFP与质膜标记蛋白SCAMP1-mCherry共定位于水稻原生质体质膜（图2B）。体外激酶实验发现，LENG的C端激酶结构域（MBP-LENG^C）无自磷酸化活性，而阳性对照OsLecRK-S.7激酶结构域则显示强烈信号（图2C）。序列比对进一步揭示LENG激酶结构域中催化关键 motifs（Gly-loop、β3-赖氨酸、HDR、DFG）存在氨基酸替换（图2D、S4），综合证实LENG为质膜定位的LRR受体样假激酶。

LENG与OsCRPK1互作并抑制其激酶活性

通过BLAST比对鉴定到水稻中AtCRPK1的4个同源基因，其中LOC_Os05g39410（命名为OsCRPK1）与AtCRPK1相似度最高（图S5）。OsCRPK1无跨膜结构域，但定位于质膜（图S6A），其激酶活性在体外实验中依赖保守Lys₆₅残基（图S6B）。表达分析显示OsCRPK1在叶片中表达最高，且受低温诱导（图S7A-B）。通过Split-LUC、BiFC、Co-IP和GST pull-down实验，证实LENG与OsCRPK1在体内外直接互作（图3A-D）。为明确OsCRPK1在LENG通路中的功能，在野生型WYG和leng突变体中构建oscrpk1敲除系。结果显示，oscrpk1单突变体及leng oscrpk1双突变体的耐冷性均显著增强，且双突变体表型恢复至野生型水平（图4A-D），表明OsCRPK1是LENG下游的负调控因子。进一步实验发现，OsCRPK1不能磷酸化LENG（图S8A），且LENG缺失不影响OsCRPK1的质膜定位（图S8B）。然而，随着MBP-LENG^C浓度增加，GST-OsCRPK1的自磷酸化水平逐渐被抑制（图5A-B），说明LENG通过直接互作抑制OsCRPK1激酶活性。

LENG干扰OsCRPK1与OsGF14d互作并调控其磷酸化

水稻中共有8个14-3-3基因（OsGF14a-h），其中OsGF14a-f在幼苗中表达（图S9）。GST pull-down实验表明OsCRPK1可直接结合OsGF14c-f（图S10），Split-LUC验证其与OsGF14d在体内互作（图5C）。体外磷酸化实验显示，OsCRPK1可磷酸化OsGF14d，且该磷酸化可被碱性磷酸酶去除（图5D）。通过Split-LUC竞争实验发现，LENG表达显著削弱OsCRPK1与OsGF14d的互作信号（图5E、S11）。AlphaFold3结构预测提示LENG与OsGF14d在OsCRPK1上结合位点重叠，存在竞争性结合（图S12）。此外，MBP-LENG^C可剂量依赖性抑制OsCRPK1对OsGF14d的磷酸化（图5D），表明LENG通过空间位阻效应阻断OsCRPK1-OsGF14d通路。

LENG等位基因在粳稻与籼稻中的分化选择

对3,000份水稻种质的LENG编码区进行单倍型分析，发现27个SNP形成7种单倍型：籼稻以I、II型为主，粳稻以III-VI型为主（图6A）。启动子区存在3,184 bp结构变异（SV），籼稻品种中约36%携带该插入，而粳稻几乎缺失（图S16A）。表达模式分析显示，携带SV的籼稻等位基因（如HHZ）在低温处理时表达无诱导，但在恢复期出现瞬时峰值；而无SV的粳稻等位基因（如WYG）在低温下快速诱导表达（图6B-C）。启动子置换实验证实，HHZ型启动子（H5K）驱动基因在低温下响应迟缓，而WYG型启动子（W2K）介导快速诱导（图S15）。地理分布分析表明，无SV种质多分布于中国北方及云贵高原等低温地区（表S2）。启动子与编码区组合互补实验显示，PwGw（WYG启动子+WYG编码区）株系耐冷性最强（存活率90%-96%），而PhGh（HHZ启动子+HHZ编码区）最敏感（11%-16%）（图6D-F）。结构预测表明，WYG与HHZ的LENG等位基因编码区差异可能影响蛋白构象及与OsCRPK1互作强度（图S14）。

讨论与机制模型

本研究提出LENG-OsCRPK1-OsGF14d模块调控水稻耐冷性的工作模型（图7）：在低温胁迫下，粳稻LENG基因被快速诱导，其编码的假激酶通过结合OsCRPK1抑制其激酶活性，并竞争性阻断OsCRPK1与OsGF14d的互作，从而解除OsCRPK1对OsGF14d的磷酸化抑制，增强耐冷性；而籼稻因启动子SV导致LENG表达滞后，且编码区变异可能削弱其抑制功能，最终表现为低温敏感性。该机制为水稻耐冷分子设计育种提供了新靶点。