《Redox Biology》：Molecular Determinants of Allosteric Modulation of Protein Disulfide Isomerase by Small-Molecule b′-ligands
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本研究针对蛋白质二硫键异构酶（PDI）变构调控机制不清的问题，通过整合热力学分析、氢氘交换质谱（HDX-MS）、人工智能辅助建模及单分子FRET（smFRET）等技术，系统解析了b′结构域小分子配体Bep2a的双重功能机制。研究发现Bep2a通过诱导左螺旋构象重排和促进PDI结构紧缩，实现对大型底物抑制与小型生理底物激活的变构调控，为设计具有定向功能输出的PDI调节剂提供了理论蓝图。
在细胞内的蛋白质折叠过程和细胞外的血栓炎症反应中，蛋白质二硫键异构酶（Protein Disulfide Isomerase, PDI）扮演着核心角色。作为硫氧还蛋白超家族的代表成员，PDI通过其氧化还原酶和分子伴侣活性，催化二硫键的形成、异构化和还原，确保蛋白质正确折叠。然而，PDI的功能异常与多种疾病密切相关，包括神经退行性疾病、癌症以及血栓炎症性疾病（如脓毒症、中风、癌症相关血栓和抗磷脂综合征）。尤其值得注意的是，位于细胞外的PDI在血栓形成过程中起关键作用，使其成为治疗血栓炎症疾病的潜在靶点。尽管针对PDI的抑制剂开发取得了一定进展，但由于其结构复杂性和变构调控机制不明确，理性药物设计仍面临巨大挑战。
PDI由四个硫氧还蛋白样结构域（a-b-b′-a′）组成，其中a和a′结构域含有催化性CGHC基序，而b′结构域含有一个疏水口袋，可作为变构调控位点。此前研究发现，小分子bepristat 2a（Bep2a）能抑制PDI对大型大分子底物的活性，同时变构增强其对小型生理底物（如GSSG和L-胱氨酸）的还原酶活性。这种双重调控功能提示b′结构域与催化中心之间存在复杂的变构通讯网络，但其分子基础和结构机制尚未阐明。为了解决这一科学问题，Nathan Ponzar等研究人员在《Redox Biology》上发表了最新研究成果，系统揭示了Bep2a与PDI相互作用的分子机制和变构调控原理。
为开展本研究，作者主要运用了以下关键技术：蛋白诱导荧光增强（PIFE）结合测定用于量化配体结合亲和力与热力学参数；丙氨酸扫描突变结合氢氘交换质谱（HDX-MS）识别关键结合残基与构象动态；人工智能辅助的AlphaFold3建模构建PDI-Bep2a复合物三维结构；结构-活性关系（SAR）分析评估Bep2a衍生物的功能差异；单分子FRET（smFRET）实时监测配体诱导的PDI构象变化；酶动力学分析测定变构调控功能。
热力学量化Bep2a与PDI的结合
研究人员首先建立基于PIFE的结合 assay，发现Bep2a在结合全长PDI时荧光信号增强约30倍，解离常数（KD）为20±5 nM。通过变温实验和范特霍夫分析，揭示结合过程以焓驱动为主（ΔH = –16.7 kcal·mol?1），并伴随显著的熵罚。结构域截断实验表明b′结构域是Bep2a结合的必要且充分条件，其他结构域对其结合能贡献可忽略。
丙氨酸扫描突变识别Bep2a与PDI相互作用的能量决定因素
针对b′结构域口袋的10个残基进行系统性突变分析，发现H256A突变导致结合亲和力降低约188倍，F249A、I301A、F304A和I318A突变也显著削弱结合（ΔΔG > 2 kcal·mol?1）。尤其值得注意的是，H256A、I289A和I301A突变引起熵贡献反转，提示这些残基对维持口袋构象和溶剂排阻具有关键作用。
HDX-MS揭示b′口袋的配体特异性动态
氢氘交换质谱分析显示，Bep2a和抑制剂rutin均能保护左螺旋区域（残基241–258）的氢交换，但Bep2a对右螺旋和脚跟区域（残基301–318）的保护更为显著，表明二者虽结合同一口袋，但诱导的构象动态存在差异。此外，Bep2a引起a′结构域的额外保护，提示其可能引发全局构象重排。
原子建模揭示b′口袋中的关键接触与配体取向
通过AlphaFold3建模约束关键残基（F249、H256、I301、F304、I318），生成25个PDI-Bep2a复合物模型。结果显示Bep2a以近乎垂直的方向插入口袋，其R1羟基与H256形成关键氢键（距离3.1 ?），R2溴原子与左螺旋疏水残基相互作用，R4胺基向外突出，作为变构调控的关键位点。结构比对发现左螺旋和F249在配体结合后发生旋转，起到动态门控作用。
结构-活性关系揭示变构激活的决定因素
通过分析5个Bep2a衍生物（NP01–NP05）发现，R1羟基替换为甲氧基（NP01）大幅降低结合亲和力但不影响变构激活功能，说明H256相互作用主要贡献于结合而非激活。相反，R4取代基的化学特性（如NP03的刚性piperazine-苯环 vs NP04的柔性甲基间隔）显著影响变构激活效能，其中NP04诱导最强的PDI紧缩和酶活性增强。
R4取代基调控构象动态与变构激活
smFRET实验证实，Bep2a和NP04促进PDI向高FRET效率的紧缩构态转变，而rutin和NP03则倾向开放构态。高FRET态占有率与酶活性增强显著正相关，表明配体诱导的构象紧缩是变构激活的结构基础。
本研究通过多学科技术整合，首次系统阐明了Bep2a通过结合PDI的b′结构域，诱导左螺旋构象重排，并通过R4取代基促进结构域间紧缩，从而实现变构激活的分子机制。研究不仅揭示了H256作为结合锚定点、R4作为变构调控点的功能分工，还提出了左螺旋作为动态门控的新调控模型。这些发现为理性设计具有定向功能输出（激活或抑制）的PDI调节剂提供了理论依据和结构蓝图，对开发针对血栓炎症性疾病和蛋白质折叠相关疾病的特异性疗法具有重要指导意义。
