《Sensors and Actuators B: Chemical》：A Signal-Amplified SERS-LFA Leveraging Multivalent Nanobodies on 2D substrates for Clinical Detection of Influenza A Virus
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纳米抗体增强的表面增强共振拉曼散射-侧流免疫层析法实现流感A病毒高灵敏度检测，临床样本验证显示其特异性优于市售金基法。
刘振振|李玉昌|王飞|方梦珂|孙彦松|康晓萍|姜涛|肖睿
中国人民解放军军事医学科学院病原生物学与生物安全国家重点实验室，北京100071
摘要
快速识别病原体是预防和控制呼吸道病毒的关键步骤。新型纳米抗体的应用在高度敏感的病原体检测方法中具有巨大潜力，但它们在应用过程中存在结构不稳定性的问题。在本研究中，我们制备了具有更高抗原亲和力的多价纳米抗体，并开发了一种基于多价纳米抗体的表面增强共振拉曼散射-侧向流动免疫层析（SERS-LFA）方法，用于高度敏感地检测甲型流感病毒（IAVs）。值得注意的是，选用了二维MoS?@Au纳米片作为免疫标记物，这种纳米片具有较大的比表面积和优异的SERS性能。此外，通过生物素-链霉亲和素放大系统将大量多价纳米抗体结合到2D MoS?@Au纳米片上。所建立的SERS-LFA方法对重组IAV核蛋白和非活性IAV的检测灵敏度分别低至1.7 pg/mL和0.15 pfu/mL，同时具有出色的特异性和重复性。进一步使用该方法检测了52份临床咽拭子样本，结果与RT-PCR完全一致，显示出比商用金基LFA更高的可靠性。
引言
甲型流感病毒（IAVs）是最常见且致病性最强的流感病毒，每年在全球范围内导致数百万人感染，甚至死亡[1]、[2]。先前感染或接种过疫苗的人仍可能被IAVs重新感染，因为这些病毒可以通过突变和进化逃避免疫[3]。许多IAV亚型可以直接感染人类，威胁人们的健康，包括H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等。2009年，新型甲型流感H1N1病毒在墨西哥引发了全球性大流行，对人类健康和经济造成了严重影响[4]。与1918年西班牙首次大规模爆发相比，及时的防控措施显著降低了死亡率，但仍导致近20万人死亡[5]。病毒的分离和培养一直是临床呼吸道病毒检测的金标准方法，但需要较长的培养时间且具有高度传染性[6]。基于病毒核酸的PCR检测方法虽然灵敏度高，但成本高昂，需要专业操作人员和仪器[7]。然而，这些方法必须在实验室中进行，耗时较长，不适合社区和资源有限的地区[8]。因此，早期快速检测IAVs对于及时有效治疗患者和防止流感病毒大规模传播至关重要。开发一种快速准确的IAVs诊断方法对于节约医疗资源和预防流感大流行至关重要。
侧向流动免疫层析（LFA）操作简便、读数快速、成本低廉且便于携带，被广泛用于临床和环境样本中蛋白质标记物、微生物、毒素和小分子的检测[9]、[10]、[11]。传统的LFA基于抗原-抗体反应，使用胶体金纳米颗粒作为显色标记物，导致灵敏度较低，仅能进行定性和半定量检测[12]、[13]。LFA检测抗原的关键在于选择具有强特异性和亲和力的合适抗体。传统的抗体制备方法主要依赖于杂交瘤技术，首先用特定抗原免疫小鼠，收集脾细胞并与骨髓瘤细胞融合，然后通过单克隆筛选分离出能够分泌特定单克隆抗体的细胞系[14]。然而，高亲和力单克隆抗体的筛选是一个耗时且劳动密集的过程。研究表明，纳米抗体易于制备，因为它们仅包含重链抗体的可变域，且对抗原的亲和力高于普通抗体[15]、[16]。1989年，Hamers-Casterman等人首次在骆驼血液中发现了一种特殊的抗体——重链抗体，这种抗体没有轻链，仅包含一个铰链区域、一个可变域和两个恒定域（CH2和CH3）[17]。此外，纳米抗体（Nbs）仅由重链抗体的可变域组成，体积小、亲水性高、成本低[18]。它们的互补决定区（CDR1和CDR3）可以更深入地结合抗原，从而识别常规抗体无法触及的隐藏表位[19]。然而，由于分子量小，VHH纳米抗体在检测应用中存在结构不稳定性的问题。Christopher A. Smith指出，同源二聚体驱动的识别是一种常见的VHH配体结合方式，为新型VHH同源二聚体亲和试剂的开发提供了机会[20]。Qianlin Li的研究表明，多价VHH的亲和力是单价抗体的100倍，这表明制备多价Nbs在高度敏感的病毒检测中具有重要作用[21]。
LFA检测抗原的另一个关键因素是制备高性能的免疫标记物，以替代传统的胶体金纳米颗粒，如顺磁颗粒、酶、荧光标记物、表面增强共振拉曼散射（SERS）标记物等[22]、[23]、[24]。然而，大多数标记物由比表面积有限的球形纳米颗粒制成，功能分子较少，当样本中目标浓度较低时可能导致假阴性结果。最近，具有较大比表面积和良好生物相容性的二维（2D）纳米材料吸引了研究人员的关注，这些材料可以负载大量功能分子，例如石墨烯、二硫化钼（MoS?）、二硫化钨和黑磷[25]、[26]、[27]。由于2D纳米材料上负载了大量功能分子（小纳米颗粒和特异性抗体），这些标记物可以提供更强的信号输出，进一步提高检测灵敏度。基于3D薄膜状纳米酶的LFA由于其优异的催化能力，检测灵敏度比胶体金基LFA高出1900倍[28]。此外，Wang等人开发了一种基于MoS?核心和多层量子点壳层的2D薄膜状纳米标记物，与传统的球形纳米标记物相比，表现出更强的信号响应、更大的反应界面和更高的稳定性[29]。尽管这些薄膜状纳米标记物提高了LFA的灵敏度，但仍存在固有缺陷。例如，基于纳米酶的标记物的催化能力容易受到环境干扰，需要多步骤操作，而荧光标记物受到背景自荧光和光漂白的显著影响。特别是SERS标记物表现出指纹样的特异性、优异的光稳定性和多重检测潜力[30]。
在本研究中，我们开发了一种基于多价Nbs的SERS-LFA方法，用于高度敏感和广谱检测不同亚型的IAVs。本研究设计了具有高亲和力的多价Nbs，并对其进行生物素化以捕获和检测病毒。具体而言，这些Nbs针对IAVs的核蛋白（NP）进行设计，以实现跨多种IAV亚型的广谱覆盖，因为NP是所有IAV结构蛋白中最保守的部分。选用了二维MoS?@Au纳米片（NSs）作为标记物基底，并依次将链霉亲和素和生物素化的Nbs结合到2D MoS?@Au NSs上。研究表明，生物素-链霉亲和素系统具有最强的生物相互作用和级联放大效应，因为链霉亲和素是一种四聚体蛋白，可以特异性结合四个生物素[31]。此外，2D MoS? NSs上负载了大量的金纳米颗粒和拉曼报告分子，不仅提供了优异的SERS性能，还为链霉亲和素提供了更多的结合位点。实验验证多价Nbs的抗原捕获能力远高于单价Nbs。在最佳条件下，所开发的多价Nbs基SERS-LFA可以检测低至1.7 pg/mL的IAVs。此外，该基于Nbs的SERS-LFA能够识别不同的非活性IAV亚型（H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2），灵敏度分别为42、0.54、0.45、0.15和0.62 pfu/mL。同时使用基于多价Nbs的SERS-LFA和商用金基LFA条带对52份临床咽拭子样本（42份IAV阳性样本和10份IAV阴性样本）进行了检测。
小节片段
在大肠杆菌中表达和纯化VHHs
对于单价VHH抗体，首先合成相应的序列（Sango Biotech），然后将其亚克隆到带有串联N端His标签或Flag标签的pET22b载体中。
重组质粒随后转化到E. coli BL21(DE3)细胞中（Thermo Scientific）。在1 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，于16°C下过夜表达蛋白质，OD600值为0.6。His标记的蛋白质按照Clontech公司的说明使用Talon金属亲和树脂进行纯化。
纯化的VHHs
基于多价Nbs的SERS-LFA原理
本研究开发的基于多价Nbs的SERS-LFA方法能够灵敏地检测多种亚型的IAVs，避免误诊并及时采取医疗和保护措施。图1a展示了Nbs基免疫标记物的制备过程：首先设计并制备多价VHH抗体，然后通过生物素-链霉亲和素系统将其与2D MoS?@Au NSs结合。选用具有较大比表面积的2D MoS? NSs作为免疫标记物基底
结论
总之，我们成功开发了一种高度敏感且广谱的SERS-LFA方法用于IAVs检测，以多价Nbs作为核心识别元件。这一性能的关键在于三种协同放大策略：1）使用多价Nbs，使其亲和力提高了50-100倍，确保了对多种IAV亚型（H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2）的强捕获和广谱检测；2）采用2D MoS?@Au纳米片作为
CRediT作者贡献声明
孙彦松：指导。康晓萍：撰写、审稿与编辑、指导、资金获取。姜涛：指导、资金获取。肖睿：撰写、审稿与编辑、指导、概念构思。刘振振：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、可视化、概念构思。李玉昌：可视化、方法学。王飞：可视化、方法学。方梦珂：方法学。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国人民解放军军事医学科学院病原生物学与生物安全国家重点实验室的支持（项目编号SKLPBS2203）。
我们非常感谢北京zkbaice技术服务公司在纳米材料表征方面的协助。
刘振振是在病原生物学与生物安全国家重点实验室肖睿博士指导下攻读博士学位的博士生，她的工作专注于基于SERS的生物传感器的开发。
