《Separation and Purification Technology》：High-throughput screening of mRNA precipitate filterability using automated image analysis
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连续生物制造中，基于沉淀的非色谱捕获方法因高效、低成本特性备受关注。研究提出一种高通量图像分析技术，通过96孔板筛选不同盐类对mRNA沉淀形态的影响，实现过滤性能与材料消耗的优化（降低达90%），为整合连续生物制造提供新工具。
Maria del Carme Pons Royo | Mateo Camara Largo | Didac Alonso Lopez | Soroush Ahmadi | Andrew Hatas | Allan S. Myerson | Richard D. Braatz
麻省理工学院化学工程系，美国马萨诸塞州剑桥市马萨诸塞大道77号，邮编02139
摘要
将沉淀作为一种非色谱、非滴度依赖的捕获方法在连续生物加工中越来越受到关注，尤其是在生物治疗领域。沉淀通过改变pH值、离子强度或添加沉淀剂来降低生物分子的溶解度，从而提供了一种可扩展且成本效益高的分离方法。沉淀后，需要有效的固液分离步骤将形成的固体从液相中去除，这通常使用切向流过滤（TFF）来完成。对于连续TFF操作而言，保持稳定的过滤性能至关重要。一个关键因素是临界通量，即在不发生显著膜污染的情况下可以维持的最大渗透通量。以往针对单克隆抗体的研究表明，缓冲液组成、盐类型和沉淀剂添加策略会显著影响沉淀物的形态和过滤性能。然而，这些关系尚未在mRNA上进行评估。准确评估堆积密度对于预测过滤性能至关重要；然而，传统的堆积密度测定方法存在吞吐量、样品体积要求和重复性方面的限制。为了解决这些问题，我们开发了一种基于高通量图像分析的方法来评估沉淀生物分子的过滤性能，mRNA被用作模型系统。从视觉数据中提取的形态特征（包括沉淀物大小和分布）可以快速筛选沉淀条件，与传统方法相比，材料消耗量减少了高达90%。这种方法有助于识别最佳盐类和添加剂，以提高沉淀效率和下游回收率，从而推动基于沉淀的可扩展捕获策略在集成连续生物制造中的发展。
引言
近年来，人们越来越关注在集成连续下游过程中用于初始捕获高价值治疗产品的非滴度依赖性和非色谱方法。其中，沉淀作为一种特别有前景的策略脱颖而出，因为它简单、可扩展，并且与连续处理兼容[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。
沉淀依赖于降低目标分子的溶解度以诱导其聚集并从溶液中去除。可以通过改变pH值、离子强度、温度或添加沉淀剂来触发沉淀过程，为生物分子的捕获提供了一种成本效益高且可扩展的解决方案[1]、[5]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]。一旦目标分子沉淀下来，就需要一个有效的固液分离步骤将其从周围液相中分离出来以便进一步处理。对于主要产物为沉淀物的过程，通常使用切向流过滤（TFF）来实现其回收。然而，TFF的连续操作面临相当大的挑战，尤其是在长时间内保持稳定的过滤性能方面。在这种情况下，一个关键参数是临界通量，即膜污染可以忽略的最大渗透通量[9]、[19]、[20]，从而确保操作的稳定性。最近的研究强调了沉淀物三维结构在其回收和溶解中的关键作用。例如，Pons Royo等人[8]表明，沉淀的单克隆抗体（mAbs）的大小分布和密度受到聚乙二醇（PEG）添加方式和持续时间的影响，进而影响其过滤性能。Minervini等人[3]发现，pH值、缓冲液和盐等因素会显著影响沉淀物的性质。此外，他们还发现某些添加剂可以稳定沉淀物结构，从而提高堆积密度和过滤性能。这些观察结果表明沉淀物内部的结构有序性与良好的过滤性能（包括提高的临界通量）之间存在密切联系。尽管这些效应在mAbs上已经得到了很好的研究，但在mRNA上尚未系统地进行研究。因此，准确评估堆积密度对于预测过滤性能至关重要，但现有方法存在明显的局限性。堆积密度通常通过批量离心来确定，其中沉淀物被压缩，并测量其质量以基于离心后颗粒的总质量计算紧凑度。然而，这种方法需要大量的样品体积和高浓度的目标分子，当处理像mRNA这样的昂贵材料时可能会受到限制。
其他用于分析沉淀物结构的传统技术，如冷冻透射电子显微镜和光散射，既昂贵又耗时[21]。因此，目前还没有一种简单、高通量的方法能够可靠地评估过滤性能。
鉴于这些限制，显然需要一些策略，能够在最小化材料消耗的同时快速、可重复地评估沉淀物的性质。基于计算机的图像分析方法提供了一个有前景的解决方案，能够在不受传统工作流程限制的情况下进行高通量分析。特别是，图像处理算法在生物技术和生物过程工程中得到了广泛应用，因为它们具有准确性、鲁棒性和适用于多种分析任务的灵活性[12]。图像分析依赖于像素级算法来提取相关特征，如颜色强度、对象边界和形态描述符（例如面积、形状、偏心率）。这些技术非常适合结构化、低复杂度的任务，具有高可解释性和易于实现的特点。当应用于沉淀研究时，它们能够表征关键的沉淀物特征，如比色性质（色调、饱和度、亮度）、形态描述符（偏心率）和尺寸估计（投影面积和体积），这些特征可以直接与重要的过程特性（如过滤性能）相关联。
在这里，我们展示了一个概念验证研究，展示了盐类型和浓度如何影响mRNA的沉淀及其后续的过滤行为。我们采用了一种高通量筛选方法，并结合图像分割技术来评估mRNA等生物分子的过滤性能。这种方法能够快速评估多种沉淀剂，有助于识别最佳候选物，从而提高生物制药纯化过程中沉淀-过滤过程的效率，同时减少时间和材料成本。此外，这一策略还可以扩展到其他生物分子，包括单克隆抗体，以系统地优化不同治疗模式下的沉淀和过滤性能。
部分片段
mRNA粗制品
所有实验使用的都是从Arranta Bio/Recipharm（美国）获得的粗Fluc mRNA（1?g/L）。样品在?20?°C下短期储存，在?80?°C下长期保存。
沉淀筛选
在沉淀筛选中，将100?μL的粗IVT mRNA溶液与来自Hampton Research（美国）的GRAS Screen? 7结晶试剂盒中的每种溶液（包含96种不同的基于盐的沉淀条件）各100?μL混合，在一个96孔U形板（ThermoFisher，美国）中进行反应。
图像分析
为了评估盐类型对mRNA沉淀形成的影响，筛选了96种不同的基于盐的沉淀条件。随后使用定量图像分析来表征沉淀物的形态、分布和强度。选择U形板是因为其弯曲的底部可以使沉淀物集中在中心，从而便于清晰区分和进行准确的形态分析。相比之下，其他类型的板可能会导致沉淀物分布不均匀或过于集中。
结论
在这项研究中，我们首次系统地研究了盐类型如何影响mRNA的沉淀及其沉淀物的过滤性能。我们展示了一种概念验证的高通量筛选方法，并结合了快速的图像分割技术来评估生物分子的沉淀过滤性能。所开发的分割算法显示出与手动测量堆积密度等传统方法相比一致的性能和非常好的重复性。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究由美国食品药品监督管理局（FDA）通过FDA BAA-22-00123项目资助，奖项编号为75F40122C00200。
