《npj Biofilms and Microbiomes》：Probiotic bacteria Bifidobacterium bifidum upregulation of intestinal epithelial tight junction barrier is mediated by TLR-2/TLR-6 receptor complex activation of occludin gene
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本研究针对炎症性肠病（IBD）等疾病中肠道上皮紧密连接（TJ）屏障缺陷的临床问题，系统探讨了益生菌Bifidobacterium bifidum strain BB1通过TLR-2/TLR-6受体复合物激活occludin基因的分子机制。研究发现BB1通过诱导TLR-2/TLR-6异源二聚体结合、IRAK-1磷酸化及TOLLIP蛋白顶端膜转位，特异性上调occludin表达，从而增强肠道屏障功能。该成果为益生菌靶向调控肠道屏障提供了新靶点，对IBD防治具有重要转化意义。
当我们谈论肠道健康时，一个经常被忽视却至关重要的角色是肠道上皮细胞之间的“紧密连接”（Tight Junction, TJ）。这道微观屏障如同守护肠道黏膜的“城门”，严格控制着物质在细胞间的穿行。当紧密连接功能受损，即出现所谓的“肠漏”（leaky gut），细菌毒素、未消化的食物大分子等有害物质便会趁虚而入，触发免疫反应，进而导致炎症性肠病（IBD）、坏死性小肠结肠炎（NEC）等疾病的发生与发展。尽管修复肠道屏障已成为治疗这些疾病的重要策略，但目前尚未有直接靶向紧密连接屏障的临床疗法获批。
在众多维持肠道健康的“益友”中，益生菌因其安全性和调节肠道菌群的潜力备受关注。然而，益生菌的作用具有显著的菌株特异性——并非所有益生菌都能有效增强肠道屏障。此前研究发现，一株名为BB1的Bifidobacterium bifidum（双歧杆菌）能显著增强肠道上皮紧密连接屏障，并有效预防小鼠结肠炎模型中的肠道炎症；而另一株BB4菌株则无此效果。但BB1究竟如何与宿主细胞“对话”，从而精准强化肠道屏障？其背后的分子机制一直模糊不清。
为揭开这一谜题，研究团队在《npj Biofilms and Microbiomes》上发表的最新研究中，从体外细胞模型到活体动物实验层层深入，揭示了BB1通过激活肠道上皮细胞表面的Toll样受体2/6（TLR-2/TLR-6）异源二聚体，进而驱动occludin基因表达，最终增强肠道屏障的完整信号通路。
关键实验方法概览
研究主要采用人结肠腺癌细胞Caco-2在Transwell滤膜上培养形成肠上皮单层，模拟肠道屏障；通过检测跨上皮电阻（TEER）和荧光标记分子（如菊粉、葡聚糖）的通透性评估屏障功能。基因沉默通过siRNA转染实现，蛋白表达与磷酸化水平通过Western blot分析，基因启动子活性通过荧光素酶报告系统检测，细胞与小鼠肠道组织中蛋白定位通过免疫荧光染色观察。动物实验使用C57BL/6野生型及肠道上皮细胞特异性TLR-2基因敲除（TLR-2ΔIEC）小鼠，通过肠道循环灌注技术活体测定肠道通透性。
研究结果
BB1特异性上调occludin表达并依赖其增强TJ屏障
在Caco-2细胞模型中，BB1处理24小时后显著提高了跨上皮电阻（TEER），降低了paracellular marker的通透性。进一步蛋白表达分析显示，BB1选择性增加了跨膜TJ蛋白occludin的表达，而对claudin-1、-2、-4、-5、-8及ZO-1、MLCK等其它TJ相关蛋白无影响。免疫荧光染色证实BB1促进了occludin在细胞顶端连接处的富集。通过siRNA敲低occludin表达，BB1对TJ屏障的增强作用被完全抑制，表明occludin的上调是BB1发挥作用的关键。机制上，BB1快速激活了occludin基因启动子活性，并提升其mRNA水平，而转录抑制剂放线菌素D可阻断这一效应。
BB1通过TLR-2/TLR-6异源二聚体激活occludin基因
利用基因工程HEK-293细胞系（分别敲除TLR-1或TLR-6）进行的受体结合实验表明，BB1特异性结合并激活TLR-2/TLR-6异源二聚体，而非TLR-2/TLR-1。在Caco-2细胞中，siRNA敲低TLR-2或TLR-6（而非TLR-1）可抑制BB1引起的occludin mRNA、蛋白上调和TEER升高，证实TLR-2/TLR-6复合物是BB1信号传导的门户。
TOLLIP（而非MyD88）介导TLR-2/TLR-6下游信号
在免疫细胞中，TLR激活通常通过MyD88适配蛋白触发促炎反应。但本研究发现，BB1并未引起IRAK-4（MyD88下游底物）磷酸化，且MyD88敲低不影响BB1对occludin及TJ屏障的上调作用。相反，BB1处理30分钟内即诱导抗炎适配蛋白TOLLIP从细胞质向顶端膜转位，该过程依赖TLR-2存在。敲低TOLLIP可阻断BB1对occludin及屏障功能的增强作用。同时，BB1诱导了IRAK-1（Thr209位点）磷酸化，敲低IRAK-1则抑制TLR-2聚集、TOLLIP转位及后续occludin上调。
动物实验验证TLR-2/TOLLIP/occludin轴在体内的作用
小鼠灌胃BB1后，肠道通透性显著降低，肠道组织occludin mRNA和蛋白表达升高，免疫荧光显示occludin在肠上皮顶端连接处富集增强，且TOLLIP发生胞质至顶端膜的转位。而在肠道上皮特异性TLR-2敲除（TLR-2ΔIEC）小鼠中，BB1的上述效应均消失，表明肠道上皮TLR-2是BB1体内作用不可或缺的媒介。
结论与意义
本研究首次完整阐释了益生菌BB1通过肠道上皮细胞TLR-2/TLR-6-TOLLIP信号轴特异性上调occludin基因，从而增强肠道紧密连接屏障的分子机制。这一发现不仅揭示了益生菌与宿主互作的新途径，而且明确了TLR-2/TLR-6异源二聚体及其下游适配蛋白TOLLIP作为潜在的 therapeutic targets，为开发以“加固肠道屏障”为目标的IBD新策略提供了理论依据。此外，该机制在乳酸杆菌LA1中的初步验证提示，TLR-2通路调控occludin可能是一些益生菌增强肠道屏障的共性机制，具有广谱研究价值。
