《Talanta》：Toehold-Mediated Strand Displacement in CRISPR/Cas12a Reactions: Advances in Programmable and Universal Biosensing Strategies
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CRISPR/Cas12a结合TMSD技术通过动态调控核酸杂交解决检测特异性、普适性及灵敏度问题，实现核酸和非核酸靶标的高效识别，拓展了分子诊断在生物医学、环境监测等领域的应用。
大卫·塞普蒂安·苏曼托·马尔庞|阿尤·奥辛·亚普·西纳加
生物系统工程系，苏门答腊理工大学，Terusan Ryacudu街，Way Huwi，Jati Agung区，南兰普ung，兰普ung，35365，印度尼西亚
摘要
基于CRISPR/Cas12a的生物传感器由于其可编程性、高灵敏度和多功能性，已成为核酸检测的强大工具。然而，诸如PAM依赖性、有限的错配识别能力以及难以检测非核酸分析物等挑战限制了它们的通用性。通过足印介导的链置换（TMSD）提供了一种可编程机制，可以通过动态调节杂交动力学和分子相互作用来克服这些限制。本综述系统地总结了将TMSD整合到CRISPR/Cas12a系统中的最新进展，包括crRNA释放、crRNA–DNA激活、激活剂生成和报告信号调节。通过将TMSD的精确链交换能力与Cas12a的转切割活性相结合，这些混合生物传感器实现了更高的特异性、可调的动力学和多分析物适应性。综述进一步讨论了设计原理、热力学基础以及在生物医学、环境和食品诊断中的应用实例。总体而言，TMSD辅助的CRISPR/Cas12a生物传感提供了一个通用的、可编程的框架，用于下一代分子诊断，具有增强的控制、灵敏度和功能多样性。
引言
准确和灵敏地检测分析物对于推进生物医学、环境和食品诊断至关重要，因为它直接影响人类健康、安全和可持续性。在生物医学领域，快速识别核酸、蛋白质和代谢物等生物标志物可以实现早期疾病诊断、个性化医疗和有效的治疗监测（1），（2）。环境监测依赖于精确的分析物检测来评估污染物、病原体和毒素，从而确保生态系统保护和公共卫生（3），（4）。同样，在食品安全方面，检测污染物、过敏原和掺假物对于质量控制和消费者保护至关重要（5），（6）。这些应用共同强调了创新生物传感技术在提供可靠、及时和成本效益高的解决方案方面的重要性，以保障健康并促进全球福祉。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）–Cas系统是分子生物学中的重要工具。在各种Cas酶中，基于CRISPR–Cas12a的检测方法最近因其高灵敏度和对多种分析物的广泛适用性而受到广泛关注，包括生物系统中的核酸和非核酸目标（7），（8），（9），（10）。对基于CRISPR/Cas12a的检测方法的需求不断增加，因为其激活可以通过单链DNA（ssDNA）或双链DNA（dsDNA）触发（11），（12），（13）。此外，激活的Cas12a酶对ssDNA报告分子表现出转切割活性，使其能够与荧光、电化学、比色和其他基于传感器的读数格式兼容（14），（15），（16），（17）。从2018年至今，关于基于CRISPR/Cas12a的生物传感器的研究论文数量稳步增长，使用“CRISPR Cas12a Biosensor”关键词在Scopus数据库中索引了683篇文章，使用“CRISPR Cas12a detection”关键词的文章有2,400篇（图1A）。在研究领域方面，化学、生物化学、遗传学和分子生物学、工程学、医学、物理学和天文学、材料科学、化学工程、农业和生物科学、环境科学、免疫学和微生物学等多个学科与CRISPR/Cas12a生物传感器研究密切相关（图1B）。这种日益增长的兴趣突显了基于CRISPR/Cas12a的检测方法在生物医学、环境和食品分析中的关键作用，为理解检测机制、疾病预防、污染物监测和风险缓解提供了坚实的基础。不断扩大的研究工作反映了人们对改进健康和安全质量的创新解决方案的日益增长的需求（9），（18）。
尽管CRISPR/Cas12a生物传感器具有诸多优势并受到广泛关注，但仍存在一些限制，如目标识别特异性受限和通用检测方面的挑战。Cas12a通过含有原间隔序列（PAM）的双链DNA进行酶促激活，并对单核苷酸错配（SNMs）表现出强烈的选择性，尤其是在PAM位点附近时（19），（20），（21）。然而，仍然存在一些障碍，包括PAM附近突变的罕见性（22）、低扩增效率（23）以及在使用PAM插入策略进行SNM检测时产生的缺陷扩增子（19），（23）。当使用单链（ss）寡核苷酸作为激活剂时，Cas核酸酶对SNMs的耐受性更强，从而能够实现激活（19）。总之，虽然双链DNA底物在通用性和灵活性方面有限，但ssDNA激活剂在SNM检测中的特异性和选择性较差。
除了目标识别方面的挑战外，CRISPR/Cas12a系统在检测某些分析物（如RNA和非核酸目标）时也会遇到困难。例如，RNA检测通常需要逆转录步骤（24），这引入了额外酶的需求，增加了成本和检测时间。同样，非核酸检测通常依赖于间接策略，其中激活剂与分析物相互作用，这些策略必须仔细设计以满足CRISPR/Cas12a的有效激活要求（25），（26）。足印介导的链置换反应（TMSD）为这些挑战提供了有希望的解决方案，使得能够更灵活、可编程和高效地检测多种分析物。
TMSD反应在CRISPR/Cas12a系统中的应用提供了一种强大的策略，以实现多种分析物的特异性和通用检测。TMSD通过设计的足印结构域可编程地控制核酸相互作用，从而引发链置换并触发下游反应（27），（28）。当与CRISPR/Cas12a结合时，TMSD可以调节激活剂的释放、生成CRISPR的RNA（crRNAs）或放大报告信号，从而提高系统的整体灵敏度和灵活性。这种组合不仅改善了目标识别，还拓宽了CRISPR/Cas12a生物传感器在检测核酸和非核酸目标方面的应用范围，为诊断和环境监测提供了多功能平台。
虽然有关TMSD（27），（29），（30），（31），（32），（33），（34），（35），（36），（37），（38），（39）和CRISPR/Cas12a生物传感器（9），（10），（40），（41），（42），（43），（44），（45），（46），（47），（48），（49），（50）的综述文章很多，但关于将TMSD整合到CRISPR/Cas12a系统中的专门讨论仍然不足。因此，本综述的目的是讨论将TMSD与CRISPR/Cas12a反应结合用于检测多种分析物的当前生物传感器。已经将多种TMSD策略整合到CRISPR/Cas12a生物传感中，包括crRNA生成、酶促激活、激活剂扩增和报告信号放大。此外，本综述还探讨了这些方法的优点和挑战。总体而言，它提供了TMSD辅助CRISPR/Cas12a诊断的全面概述，为未来的研究和开发提供了指导。
TMSD的热力学原理和生物传感应用
TMSD反应从根本上受到核酸杂交热力学和动力学原理的支配（29），（31），（33）。该过程始于成核步骤，其中入侵链（I）与基底–现有双链（S–B）上的暴露单链足印结构域（T）杂交。这一步在能量上是有利的，因为它建立了多个沃森-克里克氢键和堆叠相互作用。随着长度和GC含量的增加，吉布斯自由能（ΔG）降低
TMSD驱动的crRNA序列释放
TMSD提供了一种可编程的机制，用于控制crRNA序列的释放或组装（图2A）。在这种方法中，crRNA链最初被隔离或阻断在包含足印区域的互补DNA/RNA结构中。当特定的触发剂（如目标核酸或来自DNA电路的中间链）与足印区域结合时，它会引发链置换并诱导碱基配对的重排，从而释放crRNA
结论与展望
总之，将TMSD与CRISPR/Cas12a技术相结合代表了生物传感领域的一项重大进展，因为它将核酸电路的可编程性和精确性与Cas12a的强大酶活性结合起来。通过采用多种策略，包括TMSD驱动的crRNA释放、crRNA–DNA激活、激活剂生成和报告信号放大，这种混合系统实现了卓越的灵敏度、特异性和适应性，能够检测广泛的分析物
CRediT作者贡献声明
阿尤·奥辛·亚普·西纳加：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，概念构思。大卫·塞普蒂安·苏曼托·马尔庞：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，监督，资源，方法论，研究，概念构思
利益冲突声明
不存在可能影响研究工作的竞争性财务或个人关系
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢苏门答腊理工大学对这项研究的支持。
