《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Perspectives on Wastewater Surveillance of Monkeypox: Current Methods and Future Needs
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本文系统评述了猴痘病毒（MPXV）废水监测（WBS）的最新进展与挑战，涵盖采样、样本处理、核酸扩增检测及数据解读等关键环节。文章重点阐述了病毒组分（病毒颗粒与核酸）的高效回收、抑制物去除及方法学验证的质控要点，提出了集混合采样、病毒富集、核酸提取、等温扩增与分子检测于一体的分析框架，并指出开发稳健、可现场部署的方法是未来的优先方向。
1. 引言
猴痘（Mpox）是由猴痘病毒（MPXV）引起的一种人畜共患病毒性疾病。MPXV是一种有包膜的双链DNA病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，基因组大小约为196–211 kb。自2022年以来，全球多地爆发了大规模的MPXV疫情，凸显了快速检测该病毒的紧迫性。然而，临床监测由于疾病的自我限制性、社会污名化以及医疗可及性差异等因素，存在病例漏报问题。废水基于监测（WBS）作为一种补充工具，可在人群水平进行监测，克服个体检测的障碍，为公共卫生应对提供早期预警和社区传播洞察。
2. 总体流程与关键技术
2.1. 废水采样
废水样本类型主要包括未经处理的原水和初沉污泥。采样地点可根据覆盖范围分为集中式污水处理厂（WWTPs）、下水道检查井（MHs）和集体居住环境（如建筑、船舶）。WWTPs采样可提供人群水平的公共卫生概览，但空间分辨率较低；MHs采样可实现更精细的社区监测；而集体居住环境的采样则精度最高。目前MPXV WBS研究主要采用WWTPs采样。采样技术包括瞬时采样、复合采样和被动采样。复合采样（通常为24小时）能更好地反映废水平均特性，灵敏度更高，但需要连续水流。被动采样器部署简便，适用于难以进入的地点。样本应在4°C下保存并尽快处理，长期储存建议在-80°C。鉴于MPXV属于风险组3病原体，样本处理需在生物安全三级（BSL-3）实验室进行，并可采用热处理（如56°C 30分钟）或化学灭活（如Triton X-100）以确保安全。
2.2. 病毒浓缩与DNA提取
病毒浓缩是从复杂废水基质中捕获和分离病毒颗粒及游离核酸的关键步骤。MPXV由于其较大的病毒颗粒尺寸（约250 nm）和表面特性，表现出对废水固体更强的亲和力，主要存在于固体组分中。常见的浓缩方法包括聚乙二醇（PEG）沉淀、电负性膜（EM）过滤、离心、超速离心、超滤以及新兴的磁珠法、铝基吸附-沉淀法和直接过滤法等。
PEG沉淀法能处理大体积样本（约1L），成本低，但耗时且易共浓缩抑制剂。电负性膜过滤快速、经济，设备要求低，但同样可能共浓缩抑制剂。离心法操作简单，但仅能捕获固体组分中的病毒。超速离心回收效率高（约47%-75%），但设备昂贵且处理体积小。超滤法快速，但膜易堵塞，回收效率较低（约10.2%）。直接从初沉污泥中提取DNA流程简单，但抑制剂含量高。磁珠法具有回收效率高（约71.2%）、可处理大体积、抑制剂共浓缩少、设备便携等优点，颇具现场应用潜力。铝基吸附-沉淀法也能处理大体积，回收效率中等（约45.5%）。
提高MPXV回收效率的一个有效策略是在DNA提取前进行病毒解离预处理，例如使用蛋白酶处理以破坏痂皮和细胞碎片，将病毒从固体基质中释放出来，并随后去除固体，从而显著减少共浓缩的抑制剂。核酸提取后，有效去除PCR抑制剂（如腐殖酸、重金属离子等）对于下游检测的可靠性至关重要，可使用商业抑制剂去除试剂盒（如Zymo OneStep PCR Inhibitor Removal Kit）或稀释法来缓解抑制。
2.3. MPXV DNA的分子检测
分子检测是WBS的核心环节。实时定量PCR（qPCR）是目前MPXV检测的金标准方法，具有高灵敏度和特异性，可用于绝对定量。常用的靶基因包括用于通用检测的G2R（G2R_G assay）、F3L，以及用于Clade II（西非分支）特异性检测的G2R_WA等。数字液滴PCR（ddPCR）对抑制剂耐受性更强，无需标准曲线即可实现绝对定量，尤其适用于低浓度病毒和复杂基质检测，但成本较高。
等温扩增技术，如环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA），在恒定温度下进行扩增，无需热循环仪，设备简单，反应快速，更适合现场应用。LAMP技术已成功用于多种水生病原体检测，其使用的Bst DNA聚合酶对抑制剂耐受性较强。针对MPXV的LAMP assays已有多项研究，靶向F3L、N1R等基因，灵敏度可达数个拷贝/反应。RPA速度更快，但技术相对不成熟，易产生非特异性扩增，常与CRISPR系统联用提高特异性。目前LAMP在MPXV废水监测中的应用尚在探索中。
测序技术可提供最高分辨率的基因组信息。靶向测序（如Sanger测序）针对特定基因区域（如G2R、F3L），可用于验证PCR结果和初步分型。全基因组测序（WGS）能获得完整的病毒基因组信息，用于毒株鉴定、变异监测和进化分析，但成本更高、更耗时。研究表明，WGS可用于废水样本中低浓度MPXV的检测和确认，并同时监测其他病毒。
3. WBS与临床病例的相关性及预警潜力
多项研究表明，废水中MPXV DNA浓度与报告的临床猴痘病例数之间存在显著相关性，支持WBS作为疫情监测和早期预警工具的有效性。通过统计模型（如随机森林算法）整合废水病毒浓度、水文参数（如化学需氧量、pH值、流量）等数据，可以预测感染人数，显示出较高的预测精度。然而，也有一些研究未发现强相关性，这可能与病例漏报、病毒排放动态差异、环境因素影响以及检测方法差异有关。将WBS数据与临床监测相结合，可以更准确地评估人群感染情况，弥补临床检测的不足。
4. 展望与未来方向
MPXV的WBS为补充临床监测、实现社区水平病原体追踪提供了强大工具。然而，该方法仍面临挑战，包括缺乏标准化的操作程序、废水中病毒载量低、存在PCR抑制剂以及数据解读和归一化（如使用PMMoV等生物标志物进行校正）的复杂性。未来的研究方向包括开发快速、低成本、适用于现场（包括资源有限地区）的样本处理和检测方法；建立标准化的全流程操作指南；深入研究MPXV在废水中的环境持久性和降解规律；加强数据共享和国际合作；以及探索将WBS应用于其他新发再发传染病的监测。通过方法学优化和标准化，WBS有望成为猴痘及其他传染病防控体系中一个可靠、高效的组成部分。
