《The Veterinary Journal》：Development and preliminary validation of a rapid on-site detection method for Schmallenberg virus using RT-RAA-LFD
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Schmallenberg病毒快速检测方法研究及初步验证。本研究开发基于RT-RAA与LFD联用的快速检测方法，通过单碱基修饰下游引物降低假阳性，灵敏度达5 copies/μL，30分钟完成检测，无需专业设备，适用于现场诊断。
赵一然|郝若军|林慧星|沈朝建|刘飞|范洪杰|单彦凯
教育部动物健康与食品安全联合国际研究实验室、单分子生物化学与生物医学实验室（Sinmolab）、南京农业大学，中国南京210095
摘要
施马伦贝格病毒（SBV）是一种新兴的虫媒病毒，可导致反刍动物出现发热、腹泻、流产和先天畸形。该疾病传播迅速，给防控工作带来了巨大挑战。自被发现以来，SBV已在欧洲范围内扩散，给畜牧业生产和国际贸易造成了重大经济损失。尽管某些地区已有疫苗可用，但有效的治疗手段仍然有限，这凸显了快速、早期和准确检测的必要性。在本研究中，我们报道了一种基于逆转录聚合酶辅助扩增（RT-RAA）与侧向流动试纸（LFD）技术的快速即时检测方法的开发和初步验证。选择了一个保守的S基因区域作为检测目标，并在引物-探针对中引入了单核苷酸修饰以减少假阳性信号。由于中国境内缺乏自然感染样本，因此使用添加了特定量质粒标准的羊胎儿组织来模拟临床样本，并通过体外转录的SBV RNA来验证该方法在RNA水平上的性能。优化后，该方法达到了5拷贝/μL的检测灵敏度。与商用qPCR试剂盒相比，该方法更快、更简单，且不需要专用实验室设备，非常适合在农场、检疫站和地区实验室进行现场检测。由于该方法能同时检测SBV及其相关病毒，因此阳性结果需要通过特定PCR或测序进行确认以准确鉴定病毒。这些结果证明了该方法的可行性，并支持其在SBV及相关病毒快速监测和控制中的潜在应用。
引言
施马伦贝格病（SB）是一种由施马伦贝格病毒（SBV）引起的新兴虫媒病毒疾病，该病毒于2011年首次在德国被分离出来（Afonso和Conraths，2014；Hoffmann等人，2012）。SBV主要感染牛、山羊和绵羊等家养反刍动物，也有在野生物种如野牛和狍子中发现的病例（Larska等人，2013）。虽然有研究评估了人类感染的潜力（Reusken等人，2012），但迄今为止尚未报告人类感染SBV的病例。在成年反刍动物中，SBV感染通常会导致发热、产奶量下降和腹泻。而在胎儿中，感染主要影响中枢神经系统，导致新生儿出现先天畸形或流产（Muskens等人，2012；Peperkamp等人，2015）。SBV的临床症状与其他具有类似早期症状的反刍动物疾病（如蓝舌病、流行性出血病、牛疱疹病毒感染、牛暂时性发热、裂谷热、阿卡班病和牛病毒性腹泻）相似，这使得临床鉴别变得困难。自发现以来，SBV已在欧洲迅速传播，并正在向亚洲扩展（Afonso等人，2014）。尽管中国尚未记录到临床暴发，但血清学证据表明某些样本中存在SBV抗体（Zhai等人，2018），这表明该病毒可能曾在中国传播。鉴于中国与欧洲之间的频繁贸易和运输往来，以及定期进口繁殖动物和肉类产品，SBV在中国传播的风险依然存在。目前尚无有效的治疗方法（Wernike和Beer，2020）。因此，如果该疾病传入中国，可能会对国内牛羊产业造成重大影响。鉴于此，开发和实施SBV监测和控制技术至关重要，以防止疾病传播并保护畜牧业。
目前，已经开发了多种检测SBV的方法（N?slund等人，2014；Aebischer等人，2014）。其中，实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）是最常用的SBV检测技术（Camar?oi等人，2019），具有高灵敏度和特异性以及定量能力。可靠的血清学方法也已建立，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、病毒中和试验和间接免疫荧光测定（IFA）（van der Heijden等人，2013；Bréard等人，2013）。ELISA是最常用的血清学方法，因其速度快、成本效益高且能够进行高通量样本检测（Endalew等人，2019）；然而，血清学方法存在局限性，因为它们只能反映过去的暴露情况，无法识别病毒血症动物。因此，检测病毒RNA对于识别活动性SBV感染的动物至关重要，尤其是在病毒血症早期阶段。此外，这些传统技术通常需要大型专业设备，耗时较长，且需要高度训练的人员，限制了其在现场应用的可行性。因此，需要一种结合高灵敏度和特异性、操作简便的快速现场诊断方法，适用于农场、港口、动物市场和疫情紧急情况。
2006年，开发了一种高灵敏度和特异性的等温扩增技术——重组酶聚合酶扩增（RPA），因其操作简便、扩增效率高和适用范围广而受到重视（Piepenburg等人，2006）。由于RPA具有更高的扩增特异性和简单的反应设置（仅需一对引物和一对探针即可实现快速核酸扩增），因此比其他等温扩增方法（如环介导的等温扩增LAMP）更具优势（Yan等人，2014）。通过对重组酶来源的改进，研究人员开发了重组酶辅助扩增（RAA），进一步优化了其对人类和动物传染病的快速诊断能力。RAA保留了RPA的优点，同时具有成本效益，更适合临床应用（Tu等人，2022）。将RAA与侧向流动试纸（LFD）技术结合使用，可以实现可视化的扩增结果，从而实现即时、定性的现场检测，无需数值分析——这对于现场诊断非常有用（Guo等人，2023）。然而，在RAA扩增过程中，扩增产物和引物二聚体都可能在胶体金试纸上产生阳性信号，这在使用RAA-LFD技术时存在假阳性的固有风险。虽然聚合酶链反应（PCR）通过高温退火实现高特异性，但RAA在室温下进行，使得在DNA扩增过程中难以消除引物二聚体（Munawar，2022）。为了解决这个问题，通过在下游引物中引入单碱基替换，有效减少了假阳性的发生，同时不牺牲扩增效率（Poritz和Ririe，2014）。这一创新显著提高了RAA-LFD检测的可靠性，为等温扩增技术中的常见问题提供了直接解决方案。此外，这种方法不仅限于SBV检测，还可广泛用于其他具有类似引物二聚体形成问题的遗传相关病毒的检测。
基于上述背景，本研究开发了一种针对SBV S基因的RT-RAA-LFD检测方法，实现快速、灵敏和可视化的现场检测（图1）。在下游引物中引入单碱基替换有效减少了假阳性，同时保持了扩增效率，检测限低至5拷贝/μL。该检测过程在30分钟内完成，所需设备极少。虽然本研究使用的是添加了质粒的样本（包括少量羊胎儿组织、全血样本和鼻拭子样本）进行初步验证，但我们还使用体外转录的SBV RNA在RNA水平上验证了检测性能，确认该方法对RNA模板同样有效。由于该方法能检测SBV及其相关病毒，阳性结果需要通过特定PCR或测序进行确认以准确鉴定病毒。这种方法在快速现场诊断、农场级监测和现场检查方面显示出巨大潜力。
试剂和样本
RNA快速等温扩增试剂盒（胶体金条型）、DNA快速等温扩增试剂盒（胶体金条型）、DNA快速等温扩增试剂盒（基础型）和HybriDetect胶体金试纸均购自Amp Future Biotech有限公司（中国常州）；施马伦贝格病毒（SBV）探针RT-qPCR试剂盒购自XuanYa Biotechnology有限公司（中国上海）；EasyPure? Simple Viral DNA/RNA试剂盒则来自TransGen Biotech
目标基因的筛选和验证
从GenBank中检索了来自不同地理区域、分离年份和遗传背景的11个代表性SBV S基因序列，并使用DNASTAR和DNAMAN软件进行了分析（图2A）。分析显示，不同SBV菌株之间的S基因片段具有高度保守性（图S1）。此外，SBV与AKAV的序列比较显示S基因具有高度同源性，5′端表现出强烈相似性，而其他部分存在显著差异
讨论
SBV是一种主要影响反刍动物的新兴传染病，由于其对该产业的经济影响而引起了全球关注（Beer等人，2013）。最初在欧洲发现后，由于国际贸易、气候变化导致的媒介分布变化以及野生动物迁移，人们对其跨境传播的可能性表示担忧（Angot等人，2014；Larska等人，2014；Sedda和Rogers，2013）。虽然SBV在其他地区尚未被广泛检测到
结论
本研究开发了一种结合RT-RAA和LFD技术的快速可视化SBV检测方法。该方法可在20分钟内实现现场检测，检测限为5拷贝/μL，优于商用RT-qPCR试剂盒。在模拟样本和有限的羊样本中表现出高灵敏度和效率，证明了该方法的有效性。尽管本研究无法使用自然感染的临床样本进行验证，但在RNA水平上
作者贡献声明
沈朝建：研究、数据管理。刘飞：监督、概念设计。郝若军：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析、数据管理、概念设计。林慧星：研究、数据管理。单彦凯：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学设计、数据分析、概念设计。范洪杰：监督、资金获取、概念设计。赵一然：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写
伦理声明
所有实验均遵循南京农业大学机构动物护理和使用委员会的指导方针（认证编号：SYXK(Su)2021–0085）。
写作过程中使用的人工智能和AI辅助技术声明
作者在写作过程中未使用任何人工智能辅助技术。
资助
本研究得到了国家重点研发计划（2021YFD1800505）和江苏省农业科技创新基金（CX(23)1029）的支持。利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。致谢
我们感谢中国动物健康与流行病学中心（CAHEC）的支持。
