《Nature Communications》：DNA methylation and lncRNA control asynchronous DNA replication at specific imprinted gene domains
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本研究针对亲本特异性表观遗传修饰如何控制等位基因异步DNA复制（RT）这一关键科学问题，通过在严格维持印记DNA甲基化（DMR）的小鼠胚胎干细胞（mESC）模型中进行全基因组及靶向复制时序分析，揭示了在Dlk1-Dio3和Snrpn等印记域，父源特异性DMR甲基化和母源Meg3 lncRNA表达是调控大规模（~750 kb）亲本依赖性RT异步的关键因子，且此过程独立于三维基因组结构（TADs）。该发现首次明确了DNA甲基化在印记域RT异步中的决定性作用，为理解发育中表观遗传与DNA复制程序的耦合机制提供了新范式。
在我们的细胞核内，DNA的复制并非同步进行，而是遵循着严格的时间程序。基因组被划分为许多区域，有些在细胞分裂周期的S期早期就被复制，而有些则要等到晚期。这种复制时序（Replication Timing, RT）与基因的活性、染色质的空间结构等密切相关，是细胞命运决定过程中的一个基本事件。有趣的是，在某些情况下，来自父母双方的同源染色体上的同一段区域，其复制时间并不同步，这种现象被称为异步复制。印记基因座，即那些表达依赖于亲本来源的基因区域，由于其父母本染色体上存在相反的表观遗传标记（如DNA甲基化），被认为是研究异步复制调控机制的理想模型。然而，亲本特异性的表观遗传修饰是否以及如何直接控制复制时序的异步性，长期以来并不清楚。此前的一些研究未能在此类区域检测到显著的异步复制，可能与细胞培养条件下印记状态的稳定性有关。
为了回答这一根本问题，由Robert Feil、Jean-Charles Cadoret和Benoit Moindrot共同领导的研究团队，在《Nature Communications》杂志上发表了一项重要研究。他们利用在无血清培养条件下、能稳定维持基因组印记的小鼠胚胎干细胞（mESC）模型，结合先进的基因组学技术，首次明确揭示了在特定的印记基因域，DNA甲基化和长链非编码RNA（lncRNA）是控制亲本特异性异步DNA复制的关键因素。
研究人员主要运用了几项关键技术：首先，他们利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入结合流式细胞分选和微阵列杂交（Array-based RT analysis）或高通量测序（Capture Repli-seq），在全基因组范围和特定靶向区域高分辨率地分析了复制时序。其次，他们构建了包括单亲（孤雌生殖PR3和孤雄生殖AK2）以及杂交（C57BL/6J与JF1品系杂交）的mESC系，以便在等位基因水平进行精确比较。第三，他们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了多种突变细胞系（如Zfp57-/-、Meg3启动子缺失等），以功能上验证候选调控因子的作用。第四，他们通过高通量染色体构象捕获（Hi-C和Capture Hi-C）技术分析了三维基因组结构（TAD），并将其与复制时序数据进行关联。最后，他们通过将mESC定向分化为神经前体细胞（NPC），探讨了异步复制在发育过程中的动态变化。
结果部分
A genome-wide survey in mESCs reveals replication asynchrony at imprinted domains
（全基因组分析在mESC中揭示印记域的异步复制）
研究人员首先对单亲（孤雌PR3和孤雄AK2）以及双亲（杂交BJ）mESC进行了全基因组复制时序分析。他们发现，在大多数印记基因域，父母本染色体的复制是同步的。然而，在染色体12远端的Dlk1-Dio3印记域，发现了最显著的异步复制：在孤雌细胞（母源基因组两份）中该区域早期复制，而在孤雄细胞（父源基因组两份）中则晚期复制，双亲mESC表现为中间时序。在染色体7的Snrpn印记域也观察到了类似但程度稍弱的异步复制（父源染色体复制早于母源）。这种异步性与印记控制区（ICR）正常的亲本特异性DNA甲基化状态相关。
A large zone of asynchronous replication comprises the Dlk1 and Meg3-Rian-Mirg imprinted genes
（一个大的异步复制区包含Dlk1和Meg3-Rian-Mirg印记基因）
为了高分辨率地解析Dlk1-Dio3域的异步复制，研究人员开发了“捕获复制测序”（Capture Repli-seq）技术。结果表明，一个约750 kb的连续区域在父母本染色体间存在显著的复制时序差异。该区域包含了父源表达的Dlk1基因和母源表达的Meg3-Rian-Mirg非编码RNA多顺反子。在杂交mESC中，通过单核苷酸多态性（SNP）分析证实，Meg3和Dlk1的母源等位基因早期复制，而父源等位基因晚期复制，这种差异取决于亲本来源而非遗传背景。
Differential DNA methylation is essential for asynchronous replication at the Dlk1-Dio3 and Snrpn domains
（差异DNA甲基化对Dlk1-Dio3和Snrpn域的异步复制至关重要）
为了验证DNA甲基化的作用，研究人员分析了两种突变mESC：Sh-1细胞（IG-DMR和Meg3-DMR被双向甲基化）和Zfp57-/-细胞（ZFP57蛋白缺失导致这两个DMR几乎完全去甲基化）。在Sh-1细胞中，父母本染色体上Dlk1-Dio3域均转变为晚期复制；而在Zfp57-/-细胞中，该域则均转变为早期复制。同样，在Zfp57-/-细胞中，Snrpn域的复制异步性也消失了。这证明亲本特异性DNA甲基化是维持这两个印记域异步复制的必要条件。
LncRNA expression controls maternal-specific early replication at the Dlk1-Dio3 domain
（LncRNA表达控制Dlk1-Dio3域的母源特异性早期复制）
由于Zfp57缺失同时影响了甲基化和基因表达，研究人员进一步解耦这两个因素。他们在Zfp57-/-背景上删除了Meg3的启动子区域（Zfp57-/-; Meg3-pro-/-），使得Meg3多顺反子不表达，但DMR保持低甲基化状态。Capture Repli-seq显示，虽然Meg3基因本身仍早期复制，但在该域近端的“Begain-Dlk1区域”（约250 kb）和远端靠近Mirg的区域（约150 kb），复制时序出现了从早到晚的转变。为了特异性地研究Meg3 lncRNA的作用（而非整个转录单位），他们构建了只缺失Meg3部分外显子但保留多顺反子其余部分表达的ΔMeg3-C1细胞。结果显示，在母源染色体上，同样的近端和远端区域出现了复制延迟。这表明Meg3 lncRNA的表达本身对于维持母源染色体上这些区域的早期复制是必需的。
Imprinted asynchronous replication and parental chromosome-specific TADs show distinct boundaries
（印记异步复制与亲本特异性TAD显示不同的边界）
通过等位特异性Capture Hi-C和CTCF染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）分析三维基因组结构，研究人员发现，尽管在野生型mESC中父母本染色体在Dlk1-Dio3域存在不同的TAD结构，但这些结构域的边界与长达~750 kb的异步复制区的边界并不重合。在Zfp57-/-细胞中（异步复制消失），父母本染色体的TAD结构变得相似，但复制时序域与TAD组织之间仍无明显的关联性。在Igf2-H19和Kcnq1等其他印记域也观察到类似现象，表明在这些特定的印记区域，复制时序的调控可以独立于三维染色质结构。
Imprinted replication asynchrony resolves during neural differentiation
（印记异步复制在神经分化过程中消解）
当将mESC分化为神经前体细胞（NPC）后，Dlk1-Dio3域的异步复制发生了显著重塑。尽管亲本特异性DNA甲基化得以维持，但父源染色体中夹区域的复制时序从晚期转变为中期，而母源染色体上仅中央部分保持早期复制，近端和远端区域不再早期复制。同时，Snrpn域的异步复制也减弱了。然而，父母本染色体特异的TAD结构在NPC中大体得以维持。这表明发育信号可以覆盖在干细胞中建立起来的异步复制程序，且这种变化与三维基因组结构的改变并非直接耦合。
讨论与结论
这项研究通过精巧的实验设计，清晰地阐明了DNA甲基化和lncRNA在控制特定印记基因域亲本特异性异步复制中的核心作用。其主要结论是：在mESC中，Dlk1-Dio3和Snrpn印记域存在显著的、亲本依赖的DNA复制异步性；这种异步性严格依赖于印记控制区（DMR）的亲本特异性DNA甲基化状态——甲基化（通常父源）与晚期复制相关，而去甲基化（通常母源）是早期复制的必要条件；在母源染色体上，由去甲基化DMR驱动的Meg3 lncRNA的表达，以顺式作用方式进一步调控该域近端和远端部分区域的早期复制；重要的是，这种大规模的异步复制域的边界与父母本特异的拓扑相关结构域（TAD）的边界并不一致，表明在这些位点，复制时序的调控可以超越并独立于整体的三维基因组组织原则；最后，这种在干细胞中建立的异步复制程序在细胞分化（向NPC）过程中会发生重塑甚至消解，提示其受到发育信号的调控。
该研究的创新意义重大。它是首次在功能上证实DNA甲基化可以直接调控特定基因组区域的异步DNA复制，挑战了此前关于DNA甲基化在全基因组范围内对复制时序影响较小的观点。研究揭示了lncRNA（如Meg3）作为一种顺式作用的染色质因子，在协调表观遗传状态与DNA复制程序中的新功能。研究还表明，尽管在全局水平上复制时序与三维基因组结构存在关联，但在受强表观遗传调控的特定区域（如印记域），这种关联可以被打破，这为了解不同层次基因组调控之间的复杂关系提供了新的视角。这些发现对于理解发育性疾病、癌症（其中常伴有印记丢失和复制失调）等病理过程中基因组稳定性的维持具有重要的启示作用。论文最终发表于《Nature Communications》期刊。
