《Nature Communications》：Evolution of the tuberculin skin test reveals generalisable Mtb-reactive T cell metaclones
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本研究针对结核病中T细胞免疫保护与病理机制难以区分的难题，通过创新性地对结核菌素皮肤试验(TST)部位进行T细胞受体(TCR)测序，结合自主研发的计算管道Metaclonotypist，首次系统描绘了体内结核分枝杆菌(Mtb)反应性T细胞克隆的动态演化图谱。研究发现TST早期为非特异性T细胞招募，后期则通过寡克隆增殖富集Mtb反应性T细胞，并鉴定出10个具有人群普适性的HLA限制性T细胞元克隆，为结核病风险分层和疫苗设计提供了新型生物标志物。
结核病至今仍是全球最致命的传染病之一，但令人困惑的是，大多数感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）的人并不会发展为活动性结核病。这背后隐藏着免疫系统与病原体之间复杂的博弈，其中T细胞作为免疫防御的关键角色，既参与保护性免疫，又可能介导免疫病理损伤。然而，长期以来科学家们面临一个核心困境：通过传统方法测量多克隆T细胞反应，始终无法有效区分哪些T细胞特征与保护相关，哪些与疾病进展相关。
问题的根源在于T细胞反应的巨大复杂性。每个T细胞通过其独特的T细胞受体（TCR）识别抗原，而针对整个Mtb蛋白质组的T细胞反应包含成千上万个克隆，它们可能识别不同的抗原表位，产生截然不同的功能效应。血液样本中Mtb反应性T细胞频率极低（仅占T细胞总数的<0.001%），而病变部位的研究又受到感染慢性化和病理过程的干扰。
为了解决这些挑战，由伦敦大学学院领导的研究团队独辟蹊径，将经典的结核菌素皮肤试验（Tuberculin Skin Test, TST）转化为一个理想的人类体内免疫反应研究模型。结核菌素是Mtb的纯化蛋白衍生物（PPD），在已具有Mtb免疫记忆的个体中，注射后2-3天会出现炎症性硬结，这是典型的T细胞介导的迟发型超敏反应。研究团队假设，通过分析TST部位招募和扩增的T细胞克隆，可以更灵敏、更特异地捕捉到Mtb反应性T细胞的特征。
在发表于《Nature Communications》的这项研究中，研究人员对223名健康志愿者的TST部位活检组织进行了系统的转录组和TCR测序分析，时间点涵盖注射后第2天（炎症高峰）和第7天（抗原特异性T细胞积累高峰）。为了从海量的TCR序列数据中挖掘出具有共性的免疫反应特征，团队还自主研发了一个名为Metaclonotypist的模块化计算管道，能够基于序列相似性对TCR进行聚类，并鉴定出那些在不同个体间共享、且与特定HLA等位基因相关的T细胞"元克隆"（metaclones）——这些元克隆代表了针对相同肽-MHC复合物的T细胞群体，尽管它们的TCR序列并不完全相同。
研究的关键技术方法包括：对223名志愿者队列进行结核菌素皮肤试验（TST）和第2天、第7天活检采样；进行批量RNA测序和T细胞受体（TCR）α和β链测序；建立模块化计算管道Metaclonotypist进行TCR序列聚类和HLA关联分析；通过体外PPD刺激外周血单个核细胞（PBMC）验证Mtb反应性TCR；利用多个外部TCR数据集（包括结核病患者肺组织和血液样本）进行元克隆验证。
转录组分析揭示TST反应从炎症到增殖的演变
研究人员首先通过全转录组测序（RNAseq）比较了第2天和第7天TST部位的基因表达谱。结果显示，虽然两个时间点都激活了类似的免疫信号通路，但第7天TST的转录组特征显示出更强的细胞周期和有丝分裂活性。进一步分析发现，细胞增殖特征与泛T细胞和CD4+T细胞特征呈显著正相关，而与CD8+T细胞或髓系细胞特征无关。这表明在第7天TST部位，确实发生了以CD4+T细胞为主的增殖反应。
TCR repertoire多样性分析显示TST反应从多克隆招募到寡克隆扩增的演变
通过对TCRβ链（因其更高的多样性而更能反映抗原特异性）的深度测序，研究人员量化了TST部位T细胞克隆 repertoire的多样性变化。与血液样本相比，第2天TST repertoire显示出扩增克隆频率增加和丰富度降低，表明记忆T细胞克隆的招募，但此时克隆优势尚有限。到第7天，TCR repertoire进一步向寡克隆性演变，表现为扩增克隆比例更高、丰富度和香农多样性降低，以及辛普森多样性下降（表明克隆优势出现）。这些发现说明，早期TST的T细胞招募选择性不强，而后期则通过选择性增殖导致 repertoire的寡克隆限制。
第7天TST高度富集Mtb反应性T细胞克隆
为了验证TST部位是否特异性地富集了Mtb反应性T细胞，研究人员采用了多种方法。首先，与血液相比，第7天TST repertoire中已知的Mtb反应性CDR3序列显著富集，而CMV或EBV反应性序列则相对减少。其次，通过分析体外PPD刺激后扩增的个体特异性（私有）TCR序列，发现这些私有PPD反应性CDR3在第7天TST中显著富集，且富集程度在从第2天到第7天发生扩增的克隆中尤为明显。这些结果共同表明，第7天TST repertoire主要由扩增的Mtb反应性T细胞克隆主导。
Metaclonotypist鉴定Mtb反应性元克隆
面对个体间TCR序列的巨大差异，研究团队开发了Metaclonotypist管道来识别T细胞元克隆。经过系统 benchmarking，他们确定基于TCRdist相似性度量和Leiden聚类算法在TCRdist阈值为15时，能最优地识别出HLA关联的元克隆。应用此管道分析第7天TST TCRβ repertoire，共发现180个HLA关联的元克隆，其中177个为HLA II类限制性，这与CD4+T细胞在TST反应中的主导地位一致。尽管只有约2.7%的唯一TCR序列被纳入元克隆（表明大部分Mtb反应性T细胞是私有的），但这些元克隆具有高度的公共性：95%以上的研究参与者至少贡献了一个元克隆。
元克隆的验证及其在人群水平的免疫优势
为了确认这些元克隆确实代表公共的Mtb反应性T细胞，研究人员在多个独立数据集中验证了它们的富集情况。结果显示，与对照组（破伤风类毒素刺激的PBMC、SARS-CoV-2感染者、癌症患者组织等）相比，TST衍生的II类HLA限制性元克隆在结核病相关样本（如结核病患者血液、肺组织，特别是病变部位CD4+T细胞）中均显著富集，证明了它们的Mtb特异性和临床相关性。
尽管在个体水平，私有PPD反应性TCR在TST repertoire中占主导，但元克隆的公共性分析揭示了惊人的人群覆盖度：仅需10个最公共的元克隆即可在全部128名参与者中识别出Mtb-T细胞反应性。元克隆的公共性在不同个体间存在异质性，并非所有携带限制性HLA等位基因的个体都表达相应的元克隆，这为研究元克隆反应与感染结局的关联提供了可能性。
讨论与结论
本研究通过高时间分辨率的TST模型，首次在体内系统描绘了Mtb反应性T细胞克隆 repertoire的演变轨迹。研究发现早期（第2天）炎症反应主要由非特异性T细胞招募驱动，而后期（第7天）则转变为由抗原驱动的、选择性Mtb反应性T细胞克隆增殖为主导。尽管大多数Mtb反应性T细胞是私有的，但通过Metaclonotypist管道鉴定的公共T细胞元克隆，代表了针对特定免疫优势表位的群体水平共享反应。
这项研究的重要意义在于：首先，它证实TST是一个有价值的实验性人体挑战模型，可用于研究结核病的免疫反应，其发现的T细胞特征与结核病肺部的T细胞富集相关，具有临床意义。其次，它提供了一种不依赖于已知抗原的、可扩展的方法（Metaclonotypist）来识别人群水平的免疫优势T细胞反应，克服了个体间TCR序列多样性的障碍。最后，所鉴定的元克隆目录为未来开发基于T细胞受体谱的结核病风险分层工具，以及通过单细胞测序进行反向表位发现、进而指导以特定保护性表位为基础的疫苗设计奠定了坚实基础。尽管当前方法可能仍低估了T细胞反应的公共性，但随着人工智能驱动的TCR相似性度量和序列聚类算法的进步，未来有望揭示更广泛的共享免疫反应，最终助力于实现更有效的结核病防控。
