《Nature Communications》：Structural basis for the dynamic conformations of AP-4 and its association with ARF1
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本研究发现AP-4衔接蛋白复合物在溶液中存在闭合与开放构象的动态平衡，其μ4亚基C端结构域（μ4-CTD）可逆地结合或解离于核心区。研究通过冷冻电镜解析了AP-4及其与ARF1复合物的结构，揭示ARF1结合仅引起AP-4构象的细微变化。突变实验表明AP-4/ARF1界面破坏会抑制复合物形成与膜招募。进一步证实AP-4的高效膜招募需要ARF1与货物蛋白（如ATG9A）的协同作用，而破坏AP-4构象灵活性会损害其介导的膜运输功能。该研究为理解AP-4缺陷综合征的病理机制提供了新视角。
细胞内膜运输是维持细胞功能的核心过程，负责蛋白质和脂质在细胞器间的精准递送。在这一过程中，衔接蛋白（AP）复合物作为关键调控因子，通过形成运输小泡包装特定货物，介导定向膜运输。在哺乳动物的五种AP复合物（AP-1至AP-5）中，AP-4独树一帜地形成非网格蛋白包被小泡，主要在高尔基体网络（TGN）发挥作用，负责多种膜蛋白（如自噬相关蛋白ATG9A）的分选。人类AP-4功能缺失会导致严重的神经发育障碍——AP-4缺陷综合征，表现为进行性痉挛性截瘫和智力障碍，但其分子机制尚不清晰。
尽管AP-4的重要性日益凸显，科学家们对其如何被招募至膜上并启动运输过程仍知之甚少。与AP-1、AP-3等类似，AP-4的膜招募依赖于小G蛋白ARF1。然而，ARF1如何与AP-4互作，以及这种互作如何调控AP-4的构象和功能，是领域内亟待解决的关键科学问题。为解决这一问题，研究人员展开了对AP-4及其与ARF1复合物的结构与功能研究。
本研究通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了单独存在的AP-4核心复合物及其与ARF1形成的复合物的高分辨率结构。出乎意料的是，研究发现AP-4在溶液中并非处于单一僵化状态，而是存在闭合与开放构象之间的动态平衡。这种动态特性主要源于其μ4亚基的C端结构域（μ4-CTD）与AP-4核心区之间的结合较为松散，使得μ4-CTD能够像“开关”一样可逆地结合或解离于核心复合物中央的空腔。更为有趣的是，即使当ARF1结合到AP-4上之后，这种构象的动态平衡依然得以维持，ARF1的结合仅引发了AP-4整体结构的细微调整。
为了探究这些结构发现的生物学意义，研究人员进行了一系列生化与细胞实验。他们发现，破坏AP-4与ARF1相互作用界面的点突变会显著抑制两者的结合，并损害ARF1介导的AP-4膜招募。然而，单独ARF1的存在或货物蛋白的存在，虽能招募AP-4至膜上，但效率有限。只有当ARF1和货物蛋白（如ATG9A）同时存在时，才能协同高效地招募AP-4。这种协同效应依赖于AP-4固有的构象灵活性，因为破坏其构象动态平衡的突变会显著削弱协同招募效率。
在细胞水平上，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了AP4B1基因敲除的HeLa细胞模型，发现AP-4功能缺失会导致货物蛋白ATG9A在高尔基体异常滞留。回补野生型的AP-4B1可以挽救这一运输缺陷，但回补那些破坏AP-4构象灵活性的突变体则无法实现挽救。这直接证明了AP-4的构象动态平衡对其在细胞中行使正常的膜运输功能至关重要。
本研究综合运用冷冻电镜结构解析、单分子荧光共振能量转移（smFRET）、体外重建实验和细胞生物学等多种技术手段。关键方法包括利用昆虫细胞系统共表达并纯化AP-4核心复合物及AP-4/ARF1复合物；采用化学交联辅助的冷冻电镜技术解析复合物的高分辨率结构；通过smFRET技术在溶液中对AP-4的构象动态进行定量分析；利用脂质体浮选实验和基于荧光显微技术的微珠招募实验，在体外重建并量化ARF1和货物蛋白对AP-4的膜招募过程；最后在AP4B1基因敲除的HeLa细胞模型中验证AP-4构象灵活性对其介导的膜运输功能的重要性。
AP-4核心复合物的生化表征与结构分析
为了研究AP-4膜招募的机制，研究人员首先对AP-4核心复合物进行了生化表征。AP-4由两个大亚基（ε和β4）、一个中亚基（μ4）和一个小亚基（σ4）组成。为了便于结构研究，去除了ε和β4亚基的铰链区和耳区，获得了由ε、β4的“主干”区域以及全长μ4、σ4组成的AP-4核心复合物。通过共表达策略和尺寸排阻色谱-多角度激光光散射（SEC-MALS）分析，证实成功获得了化学计量比为1:1:1:1的异源四聚体复合物。
AP-4核心复合物的冷冻电镜结构
通过冷冻电镜单颗粒分析，研究人员解析了AP-4核心复合物的结构。令人意外的是，数据分析清晰地显示出两类不同的颗粒，对应AP-4的两种构象状态。一类颗粒呈现“碗状”构象，中央有空腔，对应μ4-CTD从核心区解离的“开放”状态；另一类颗粒也呈类似架构，但中央有空腔被占据，对应μ4-CTD“停靠”在核心区的“闭合”状态。两种状态的冷冻电镜地图分辨率分别达到4.2 ?和4.1 ?。结构比较发现，两种状态下核心复合物的整体架构相似，但μ4-CTD的位置显著不同。对未交联的AP-4样品的重新分析确认了这两种构象是AP-4固有的特性，而非交联方法引入的假象。
AP-4与其他AP复合物构象的结构比较
将AP-4的结构与其他AP复合物（AP-1、AP-2、AP-3）进行比较发现，AP-4在溶液中即可存在闭合与开放的动态平衡，这与AP-1和AP-2需要膜或货物触发构象转换，以及AP-3主要呈开放构象的特性均不相同。这种独特的动态特性可能源于μ4-CTD与核心区相对松散的相互作用界面，以及μ4亚基内较长的连接区序列。
AP-4/ARF1复合物的组装与结构
研究人员进一步组装了AP-4与ARF1的复合物，并解析了其冷冻电镜结构。在AP-4/ARF1复合物中，同样观察到了对应于μ4-CTD停靠和解离的两种构象状态，分辨率分别为6.8 ?和6.6 ?。结构显示，一个ARF1分子结合在AP-4大亚基ε的N端区域，这是一个在其他AP复合物中保守的ARF1结合位点。然而，之前研究预测的位于μ4-CTD上的第二个ARF1结合位点在此结构中未被解析，可能与μ4-CTD本身的动态柔性有关。
AP-4核心及AP-4/ARF1复合物中μ4-CTD的多构象
单分子FRET（smFRET）分析定量揭示了AP-4核心复合物中μ4-CTD存在多种构象的动态平衡，包括闭合态、部分闭合态和伸展态。ARF1的结合会引起不同构象群体分布的轻微变化，但并未显著改变其动态本质。三维变异性分析（3DVA）进一步以视频形式直观展示了μ4-CTD的动态无序性，支持了其构象连续变化的观点。
ARF1与AP-4在膜锚定复合物中的结合
通过将AP-4/ARF1复合物结构与膜锚定的ARF1结构进行比对，研究人员构建了膜锚定AP-4/ARF1复合物的模型。模型表明，无论是闭合态还是开放态，AP-4/ARF1复合物都能通过ARF1结合被招募至膜上。在闭合态模型中，μ4-CTD上的货物结合位点仍然暴露，可供结合膜货物；而在开放态模型中，μ4-CTD从核心区释放，更易于结合膜货物。
ARF1与货物对AP-4高效招募的协同效应
为了验证ARF1与货物蛋白的协同作用，研究人员设计了基于荧光显微镜的微珠招募实验。将带有荧光的AP-4核心复合物与包被了ARF1、货物肽（ATG9A肽段）或两者同时包被的微珠共同孵育。结果显示，ARF1或ATG9A肽段单独存在时均可招募AP-4至微珠，但两者共存时，AP-4的招募效率显著高于两者单独作用效果的简单加和，表现出明显的协同效应。重要的是，破坏AP-4构象灵活性的突变体（E395R）严重削弱了这种协同招募效应。
AP-4的构象灵活性对其膜运输功能至关重要
细胞功能实验进一步证实了AP-4构象灵活性的生物学意义。在AP4B1基因敲除的HeLa细胞中，货物蛋白ATG9A在高尔基体出现滞留。回补野生型AP-4B1可以挽救此运输缺陷，但回补破坏μ4-CTD与核心区相互面的点突变体（如E395R, Y322R/V359S等）则无法实现挽救。这表明，维持AP-4核心复合物的构象动态平衡对其介导的细胞内膜运输功能是不可或缺的。
研究结论与意义
本研究系统地揭示了AP-4衔接蛋白复合物独特的构象动态特性，及其在ARF1和货物蛋白协同介导的膜招募过程中的核心作用。主要结论包括：首先，AP-4在溶液中固有地存在闭合与开放构象的动态平衡，这不同于其他AP复合物。其次，ARF1的结合对AP-4的整体构象影响甚微，其构象平衡得以维持。第三，AP-4的高效膜招募需要ARF1和货物蛋白的协同作用，而这种协同效应依赖于AP-4自身的构象灵活性。最后，破坏AP-4的构象灵活性会损害其介导的膜运输功能，这为理解AP-4缺陷综合征的病理机制提供了新的结构基础。
该研究不仅深化了对AP-4生物学功能的理解，揭示了其作为一种构象动态复合物的新特征，更重要的是提出了“协同检测”模型：AP-4通过其构象灵活性，能够协同感应膜上的ARF1和特定货物蛋白的存在，从而确保膜运输过程的高度特异性和效率。这一模型为理解其他动态蛋白复合物的工作机制提供了新范式。此外，研究中解析的高分辨率结构为未来开发针对AP-4功能异常相关疾病（如遗传性痉挛性截瘫）的潜在治疗策略奠定了重要的理论基础。论文发表于《Nature Communications》期刊。
