《Nature Communications》：An alternative EGFR activation by patient-derived R252C mutation promotes cancer progression
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本研究针对EGFR胞外域（ECD）突变致癌机制不清、缺乏有效治疗策略的难题，揭示了患者来源的EGFR R252C突变通过C252-C252二硫键介导的受体二聚化，诱导构象改变，直接磷酸化并激活ERK1/2（T202/Y204），从而驱动肿瘤增殖。研究发现第二代EGFR-TKI阿法替尼（afatinib）可有效抑制该突变肿瘤生长，为携带此类ECD突变的肺癌和胶质瘤患者提供了新的治疗依据。
表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）是细胞表面的一种重要受体酪氨酸激酶，它在调控细胞增殖、存活、迁移等过程中扮演着关键角色。当EGFR发生突变时，常常会导致其信号通路异常激活，进而驱动肿瘤的发生与发展。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，EGFR的突变主要集中在激酶域（Kinase Domain, KD），例如常见的19号外显子缺失和L858R点突变，这些突变对第一代和第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitors, TKIs）通常较为敏感。然而，在胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）等癌症中，EGFR的突变则更频繁地出现在其胞外域（Extracellular Domain, ECD）。尽管ECD突变在癌症患者中占有相当的比例，但与KD突变相比，人们对ECD突变如何导致EGFR异常激活并驱动肿瘤生长的机制了解甚少，且目前尚无针对ECD突变的有效靶向治疗策略获批，这成为临床治疗面临的一大挑战。
近日，发表在《Nature Communications》上的一项研究为解决这一难题带来了新的突破。研究人员从一个患有同时性多发性肺癌和胶质瘤的患者身上，发现了一种位于EGFR胞外域的罕见点突变——R252C（即第252位的精氨酸突变为半胱氨酸）。该研究深入揭示了EGFR R252C突变通过一种前所未有的非经典机制直接激活下游信号通路，从而促进癌症进展，并证实了第二代EGFR-TKI阿法替尼对该突变的有效抑制作用。
为了探究EGFR R252C的致癌机制，研究人员综合运用了基因编辑、细胞生物学、生物化学、结构生物学模拟以及临床前动物模型等多种技术方法。关键实验技术包括利用CRISPR-Cas9技术构建EGFR R252C敲入的胶质瘤细胞系（U87, U251）和非小细胞肺癌细胞系（H1299）以及患者来源的胶质瘤干细胞系（GSC387）；通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）和体外Pull-down实验分析蛋白质相互作用；进行体外激酶实验验证直接磷酸化；利用非还原性SDS-PAGE和蛋白质交联实验分析二聚体形成；采用分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulation）解析突变引起的构象变化；通过NanoBiT蛋白相互作用分析检测激酶域距离；并建立颅内原位移植瘤和肺原位移植瘤小鼠模型进行体内药效评估。患者样本来源于一例经循环肿瘤DNA（ctDNA）测序发现EGFR R252C突变的肺癌合并胶质瘤病例。
EGFR R252C促进肿瘤细胞增殖和体内肿瘤生长
研究人员首先在癌症基因组图谱（TCGA）数据库中发现EGFR R252C突变存在于0.4%的胶质瘤患者中。他们通过CRISPR-Cas9技术成功构建了携带EGFR R252C敲入的U87、U251和H1299细胞系。功能实验表明，与野生型（WT）相比，EGFR R252C突变显著增强了这些肿瘤细胞的增殖能力和集落形成能力。在动物模型中，颅内注射表达EGFR R252C的U87细胞的小鼠，其肿瘤生长速度远快于注射野生型细胞的小鼠；同样，肺原位注射表达EGFR R252C的H1299细胞也导致了更快的肺部肿瘤生长。这些结果证实了EGFR R252C突变具有强效的促癌能力。
EGFR R252C磷酸化并激活ERK1/2
为了探明其促增殖机制，研究人员检测了EGFR下游关键信号通路。令人惊讶的是，EGFR R252C的表达并未像典型EGFR激活那样增加EGFR自身多位点（如Y1068）的磷酸化水平，也未显著激活MEK、AKT或STAT3信号，但却显著提高了细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2）在T202和Y204位点的磷酸化水平。这种ERK1/2的激活可被EGFR抑制剂阿法替尼所抑制，而ERK1/2抑制剂ravoxertinib则能有效逆转EGFR R252C带来的增殖优势，表明ERK1/2的激活是其致癌信号的关键下游效应器。进一步研究发现，这种激活不依赖于经典的RAS/RAF/MEK通路，因为抑制RAS（tipifarnib）、RAF（dabrafenib）或MEK（trametinib）均不能阻断ERK1/2的磷酸化，敲低MEK1/2也得到相同结果。免疫共沉淀和体外Pull-down实验证实，EGFR R252C能直接与ERK1/2结合，且结合强度高于野生型EGFR。更重要的是，体外激酶实验直接证明，EGFR R252C能够直接磷酸化ERK1和ERK2。这表明EGFR R252C绕过经典通路，直接磷酸化并激活ERK1/2。
EGFR R252C依赖性ERK1/2激活的结构基础
那么，R252C突变是如何导致这种非经典激活的呢？分子动力学模拟揭示了其结构机制。R252C突变导致两个EGFR单体在252位的半胱氨酸之间形成二硫键（C252-C252 disulfide bond），从而稳定了受体的二聚化。这种二聚化诱导EGFR胞外域、跨膜区（Transmembrane, TM）和近膜区（Juxtamembrane, JM）发生构象改变，使其类似于配体（如EGF）结合后的活性状态。然而，与配体激活的野生型EGFR不同，EGFR R252C二聚体的两个激酶域（KD）之间的距离增大，且活性中心的取向发生改变，这导致其自身磷酸化（autophosphorylation）水平缺失，但却为ERK1/2的结合和磷酸化创造了更有利的条件。MM-GBSA结合自由能计算显示，EGFR R252C的KD二聚体与ERK1的结合力远强于野生型。通过点突变和功能验证，研究人员进一步确定P919是EGFR R252C与ERK1/2结合的关键残基。这些结构变化是EGFR R252C能够直接高效激活ERK1/2的根本原因。
阿法替尼抑制EGFR R252C驱动的肿瘤细胞增殖和体内肿瘤生长
针对这一独特的激活机制，研究人员评估了不同代EGFR-TKIs的疗效。结果显示，第二代不可逆性EGFR-TKI阿法替尼能够以剂量依赖的方式有效抑制EGFR R252C诱导的ERK1/2磷酸化以及肿瘤细胞的增殖和集落形成，而第一代（吉非替尼gefitinib、厄洛替尼erlotinib）和第三代（奥希替尼osimertinib）TKI则效果甚微。在动物模型中，阿法替尼治疗能显著抑制表达EGFR R252C的颅内和肺部肿瘤的生长，并延长荷瘤小鼠的生存期。最令人鼓舞的是，回顾性临床数据显示，那位携带EGFR R252C突变、对含铂化疗、贝伐珠单抗联合化疗以及KEYTRUDA免疫治疗均无效的多发性肺癌和胶质瘤患者，在接受阿法替尼治疗后，肺部和脑部的肿瘤负荷显著减少，病情得到长期控制，无进展生存期显著延长。
综上所述，本研究首次系统性地揭示了一种患者来源的EGFR胞外区R252C突变通过形成二硫键介导的二聚化，诱导受体构象改变，从而直接结合并磷酸化ERK1/2（T202/Y204），以一种不依赖于经典MEK激活的全新机制驱动肿瘤生长。研究不仅阐明了该ECD突变独特的致癌机制，更重要的是，通过临床前实验和个案报道，强有力地证明了第二代EGFR-TKI阿法替尼是治疗携带EGFR R252C突变的肺癌和胶质瘤患者的潜在有效策略。这项工作深化了对EGFR胞外域突变功能的理解，为针对这类目前缺乏有效治疗手段的突变提供了重要的理论依据和临床启示，强调了基于突变位点的精准治疗在癌症管理中的重要性。
