《Virulence》：Exogenous indole promotes florfenicol tolerance in Edwardsiella tarda
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本研究揭示了外源吲哚通过代谢重编程增强迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）对氟苯尼考的耐受性。研究发现，吲哚扰乱三羧酸循环（TCA cycle），增加细胞内NADH和活性氧（ROS）水平，激活芬顿反应（Fenton reaction）和外排泵，同时降低膜通透性，从而减少抗生素积累。体内实验证实吲哚削弱氟苯尼考对罗非鱼感染的疗效。该研究为水产养殖中抗生素与代谢物联用的潜在风险提供了新见解。
外源吲哚促进迟缓爱德华氏菌对氟苯尼考的耐受性
摘要
细菌代谢对抗生素耐药性和耐受性具有重要影响。然而，吲哚对细菌代谢和抗生素效力的影响尚未完全阐明。本研究探讨了外源吲哚对淡水及海水鱼类养殖中常见病原体——迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）抗生素敏感性的影响及其具体机制。研究发现，外源吲哚促进了迟缓爱德华氏菌对氟苯尼考的耐受性，并重编程了其代谢组。共检测到108种代谢物，其中66种差异代谢物调控多种代谢途径，如三羧酸循环和核苷酸代谢。外源吲哚通过增加细胞内NADH含量、激活呼吸链以提高活性氧水平，进而增加细胞内Fe2+含量以激活芬顿反应，从而促进氧化应激反应。此外，吲哚抑制抗生素进入细胞并激活外排泵以降低细胞内抗生素含量，最终促进抗生素耐受性。在体内，外源吲哚削弱了氟苯尼考保护鱼类生存和清除病原菌的能力。这些结果揭示了吲哚诱导的代谢变化，并为解决水产养殖中迟缓爱德华氏菌的抗生素耐受性和临床感染提供了未来方向。
引言
革兰氏阴性菌迟缓爱德华氏菌是肠杆菌科的典型代表。由于其在水生环境中的丰富存在，迟缓爱德华氏菌是淡水和海水鱼类养殖中的常见病原体，靶向多种鱼类并导致巨大的经济损失。抗生素用于预防和控制细菌感染，但其过度使用诱导细菌耐受性，这通常在细菌进化过程中先于耐药性发展。与细菌耐药性不同，细菌耐受性使种群在不改变最低抑菌浓度的情况下存活抗生素，且并非由基因突变引起。细菌耐受性支持细菌种群的持续存活，从而增加了罕见耐药突变出现的可能性。
代谢物是细菌代谢过程的产物，在细菌功能中扮演重要角色；因此，代谢组学技术已成为研究细菌耐受性的重要工具。先前研究表明，氨基酸代谢的变化可以增加脓肿分枝杆菌对抗生素治疗的耐受性。外源添加代谢物改变细菌的代谢状态，进而影响其对抗生素的敏感性。
吲哚被认为是工业和农业废水中的典型N-杂环芳香污染物，也是一种具有广泛环境存在的生物活性信号分子。这种内源性细菌代谢物由超过85种细菌物种产生，显著影响细菌生理和代谢。吲哚影响产吲哚和非产吲哚细菌的抗生素耐药性和耐受性。
结果
外源吲哚促进迟缓爱德华氏菌对氟苯尼考的耐受性
外源吲哚处理后，迟缓爱德华氏菌ATCC15947对氟苯尼考的敏感性降低，表现为细菌存活率增加。这种效应具有浓度依赖性，在2 mM吲哚浓度下，观察到最大程度地降低抗生素敏感性。与单独使用氟苯尼考相比，外源吲哚与氟苯尼考共同添加时增强了细菌运动性并减小了抑菌圈大小。最低抑菌浓度测定显示，吲哚处理并未改变MIC值，表明吲哚处理后的细菌存活率增加是由于细菌耐受性增强而非耐药性。除氟苯尼考外，吲哚还促进了迟缓爱德华氏菌ATCC15947对红霉素、氯霉素、多西环素和环丙沙星的耐受性，且其MIC未改变。此外，吲哚处理对溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌ATCC15947和嗜水气单胞菌Ah-HN1的氟苯尼考耐受性具有类似效应，表明这种效应可能在水产养殖细菌中普遍存在。
外源吲哚改变迟缓爱德华氏菌代谢组
代谢组学用于分析外源吲哚添加后迟缓爱德华氏菌ATCC15947细胞的代谢变化。共鉴定出108种代谢物，分为六类：氨基酸、核苷、碳水化合物、脂肪酸、脂质和其他，分别占21%、26%、12%、17%、11%和13%。吲哚处理后共有66种代谢物显示差异丰度，其中37种上调，29种下调。差异代谢物中，氨基酸代谢物主要下调，而其他类别的代谢物主要上调。
外源吲哚重编程迟缓爱德华氏菌代谢组
主成分分析显示差异代谢物能区分处理组和对照组。通路富集分析揭示了13条通路，其中影响值最高的前五条通路分别为β-丙氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；谷胱甘肽代谢；D-氨基酸代谢；和嘧啶代谢。参与显著富集通路的差异代谢物中，作为中心碳代谢途径的三羧酸循环中的代谢物主要下调。iPath 3.0分析进一步证实外源吲哚添加后迟缓爱德华氏菌ATCC15947细胞中的TCA循环下调。这些结果表明吲哚重编程了迟缓爱德华氏菌代谢组并扰乱了TCA循环。
外源吲哚激活呼吸链
TCA循环是丙酮酸循环的一部分。在P循环物质中，丙酮酸因吲哚处理而上调，而柠檬酸、琥珀酸和苹果酸下调。这三种下调代谢物被鉴定为TCA循环的组成部分。TCA循环相关基因的表达分析显示，除fumC未变外，吲哚抑制了它们的表达。外源添加这三种代谢物均显著恢复了迟缓爱德华氏菌ATCC15947对氟苯尼考的敏感性。丙酮酸脱氢酶活性未变，而三种关键TCA循环酶中，仅柠檬酸合酶活性被抑制，其他未变。有趣的是，代谢组学分析中未发生丰度变化的TCA循环其他代谢物，如草酰乙酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸和富马酸，也能恢复对氟苯尼考的敏感性，表明代谢物调控细菌对抗生素敏感性的复杂性。
由于这些代谢物参与NADH产生，其丰度变化可能影响细胞内NADH水平；因此，我们测定了细胞内NADH含量。出乎意料的是，吲哚处理后细胞内NADH含量显著增加，而氟苯尼考处理降低了该水平。吲哚添加逆转了氟苯尼考引起的NADH降低。通过测定NADH产生酶苹果酸脱氢酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，发现吲哚显著增加了它们的酶活性。此外，NADH脱氢酶相关基因的表达水平测定显示吲哚降低了它们的表达。NADH通过电子传递链转化为ATP，我们的结果表明吲哚处理增加了细胞内ATP含量。随后，添加CCCP抑制呼吸链显著降低了迟缓爱德华氏菌ATCC15947对氟苯尼考的耐受性。这些结果提示外源吲哚扰乱TCA循环但增加细胞内NADH含量，从而增强呼吸链活性和ATP产生。
外源吲哚增加ROS水平诱导氧化应激
NADH作为电子载体，为呼吸链提供电子进行传递，然后经过氧化磷酸化产生超氧化物。因此，NADH含量的变化也会影响ROS水平。本研究中，吲哚处理后细胞内ROS水平显著增加，并与吲哚含量呈浓度依赖性关系。为验证增加的ROS是否引起细菌耐受性，我们在培养液中添加了ROS清除剂硫脲。清除ROS后，迟缓爱德华氏菌ATCC15947对氟苯尼考的耐受性显著降低。由于ROS与芬顿反应相关，我们测定了细胞内Fe2+，发现外源吲哚添加引起细胞内Fe2+显著增加。此外，向迟缓爱德华氏菌ATCC15947细胞添加不同Fe2+浓度代替吲哚，我们观察到细胞内ROS水平随Fe2+呈浓度依赖性增加，细菌存活率也逐渐增加。再者，添加Fe3+与吲哚共同以逆转芬顿反应，导致细胞内ROS水平和细菌存活率均显著降低。
为进一步验证，我们添加去铁酮以清除细胞内Fe3+。结果显示，随着Fe3+含量降低，迟缓爱德华氏菌ATCC15947细胞的存活率增加。最后，我们测定了ROS诱导的氧化应激和Fe2+调控相关基因的表达。我们发现，参与氧化应激反应的关键调节因子oxyR-1、oxyR-2和rpoS，以及相应的调控基因katG和sodB显著上调，而sodC1表达未变。细胞内Fe2+含量增加提高了铁摄取调节因子fur的表达，并降低了主要Fe2+转运蛋白基因feoB的表达，而其他Fe2+转运蛋白基因feoC的表达未变。这些结果表明外源吲哚诱导细胞内ROS水平增加并促进芬顿反应，进而刺激氧化应激反应，触发相关基因表达变化，从而使迟缓爱德华氏菌存活。
外源吲哚促进外排泵以减少细胞内抗生素含量
细菌细胞膜中有许多外排泵系统，它们可以激活以泵出抗生素并提高存活率。使用荧光染料溴化乙锭测定细菌外排泵活性，其与荧光强度呈负相关。吲哚和氟苯尼考处理的迟缓爱德华氏菌外排泵活性大于单独氟苯尼考处理的细菌。吲哚处理显著增加了外排泵基因emrA、mdfA、ycaD和bmr3的表达，分别增加1.88、3.00、3.59和3.06倍，而emrB表达未变。接下来，将常见外排泵抑制剂维拉帕米与联合组共同孵育；结果显示，抑制外排泵活性显著减弱了吲哚处理诱导的迟缓爱德华氏菌耐受性增加。由于增强的ROS水平可以激活细菌外排泵，我们将ROS清除剂硫脲与联合组共同孵育；结果显示外排泵活性随硫脲浓度增加而降低。我们先前的结果表明吲哚处理后ROS增加也增加了细胞内Fe2+含量，我们向迟缓爱德华氏菌ATCC15947添加不同Fe2+浓度并测试其外排泵活性。正如预期，Fe2+含量增加激活了细菌外排泵。我们随后测定了细胞内氟苯尼考含量，其在吲哚添加组显著降低。这些结果证明吲哚可以通过增加ROS水平激活细菌外排泵，从而促进抗生素外排，进而增加细菌耐受性。
外源吲哚改变膜通透性以抑制抗生素内流
质子动力由跨膜质子梯度（?pH）和电势（?φ）组成。与单独氟苯尼考组相比，联合组的?pH值显著降低，而?φ未变。随后，我们测定了四个处理组的膜通透性：联合组的膜通透性显著低于单独氟苯尼考组。细胞质泄漏测定的结果与膜通透性结果一致，间接代表了细胞膜的完整性。两种典型外膜蛋白编码基因ompA和ompW的表达显著增加，而编码主要细菌脂蛋白的基因lpp表达也显示类似的显著增加。这些结果通过显微镜进一步验证，显示联合组细菌细胞膜更光滑，无过度皱纹且比单独氟苯尼考组有更多电子致密区域。这些结果表明吲哚和氟苯尼考联合处理影响迟缓爱德华氏菌的膜通透性。
外源吲哚减弱氟苯尼考对鱼类感染的保护效力
鉴于吲哚增强迟缓爱德华氏菌对氟苯尼考的体外耐受性，我们进一步研究其体内影响。由于迟缓爱德华氏菌是引起多种鱼类感染的常见病原体，我们建立了尼罗罗非鱼感染模型。细菌感染24小时后，用盐水、吲哚、氟苯尼考或氟苯尼考和吲哚组合处理鱼。结果显示，盐水和吲哚组之间存活率无显著差异，两组均显示约20%的存活率。相反，氟苯尼考处理将存活率提高至55%。然而，氟苯尼考+吲哚组的存活率逐渐下降，第3天降至25%并此后稳定。在细菌易感器官，包括肝脏和肾脏，菌落形成单位计数表明氟苯尼考处理将细菌负荷降低近一个数量级。相反，氟苯尼考+吲哚处理导致细菌数量反弹。组织切片组织病理学分析进一步证实这些发现。尽管氟苯尼考处理将细胞形态恢复至与未感染对照组相当的水平，但盐水和氟苯尼考+吲哚组均显示广泛空泡化，表明显著组织损伤。总之，这些体内结果证明吲哚不仅不能提高鱼类存活或细菌清除，反而损害氟苯尼考的保护效应。
讨论
抗生素用于治疗细菌感染；然而，随着全球抗生素使用显著增加，细菌抗生素耐药性问题在过去几十年加剧。耐药细菌对人类健康构成重大威胁，细菌对抗生素的耐受性可严重影响细菌感染的治疗，可能导致治疗失败和慢性感染复发。细菌耐受性被认为是一种适应性特征，使细菌能够在
