《Emerging Microbes & Infections》：Post-mortem surveillance: an innovative strategy to detect and prevent spread of Nipah virus infection in humans
摘要
尼帕病毒（NiV）仍是孟加拉国持续存在的公共卫生威胁。尽管自2006年起已建立国家哨点监测系统，但许多在评估前已死亡的感染者往往未被检测。本研究于2023年12月至2024年4月期间在三家哨点医院试点开展了尸检监测部分。训练有素的人类学家在获得近亲书面知情同意后，于死亡后短时间内非侵入性采集口腔拭子样本，并通过qRT-PCR在国家参考实验室检测NiV RNA。样本在现场BSL-2 plus条件下处理，并按照国家标准操作规程使用液氮干式运输器运送。根据流行病学风险指示，对部分样本进行优先快速检测。在筛查的246例死者中，10例符合疑似NiV病例定义并纳入研究；所有病例均为入院后死亡。其中1例死者检测为NiV阳性（Ct值27.3），结果触发了由IEDCR国家快速反应团队实施的当日疫情调查。对密切接触者及一名同源暴露者进行了追踪和检测（急性期RT-qPCR/IgM；6周后IgG），未发现继发病例。操作时间线（死亡→纳入→采集→检测）表明，尸检采样和确认可在常规医院工作流程中快速完成。尸检口腔拭子检测具有可行性、可接受性，且与孟加拉国的国家监测系统操作兼容。此方法虽非旨在提高对存活患者的检测，但通过识别先前未检测的致命感染并为及时的公共卫生响应提供触发点，弥补了一个关键缺口。在哨点扩大推广此方法可加强NiV流行地区的早期检测和疫情控制。
引言
尼帕病毒（NiV）发现二十五年后，该病原体仍构成重大公共卫生威胁，且尚无批准的人用疗法或疫苗。自1998-1999年在马来西亚和新加坡首次出现以来，南亚和东南亚的其他三个国家（印度、孟加拉国和菲律宾）也报告了疫情。在印度次大陆，病毒主要由
蝙蝠携带，自2001年以来，孟加拉国几乎每年都报告人类感染病例。面对这一持续的公共卫生威胁，孟加拉国流行病学、疾病控制与研究所（IEDCR）和国际腹泻病研究中心，孟加拉国（icddr,b）在美国疾病控制与预防中心（US CDC）的技术支持下，于2006年启动了基于医院的哨点监测系统。该系统分布在所有八个行政分区的主要三级医院，实现了对人间NiV感染疫情的全面监测、识别和响应。自启动以来，三分之二的报告尼帕病例通过该平台检测，其余通过其他医疗机构的基于事件/特别报告识别。
当前的监测系统仅包括评估时存活的个体。因此，若具有NiV样疾病史的人在死后被送至监测机构，或在到达医院后不久死亡，则不会被纳入监测， consequently，他们未接受NiV感染检测。
此外，孟加拉国NiV疫情调查数据显示，约25%的报告人间NiV感染是疑似病例；这些个体具有与NiV感染一致的症状并与实验室确诊病例有流行病学关联。这些人在能够被纳入前就已死亡，因此从未接受NiV检测。而且，孟加拉国已有尸体向人传播NiV的记录， often with fatal outcomes。这些观察结果共同指出，需要对死后出现尼帕感染症状的个体进行检测，以指导感染预防措施和必要的公共卫生响应及缓解工作。
为弥补这一病例检测缺口，我们于2023年在现有国家系统内试点实施了尸检监测。本文描述了实施过程，呈现了试点研究的结果，并评估了尸检检测对尼帕病毒疫情检测和响应的潜在贡献。
材料与方法
伦理声明
本研究方案（PR-2005-026）获得了icddr,b伦理审查委员会（ERC）的批准。从在场的死者近亲处获得了纳入研究的书面知情同意。根据批准的方案，仅允许对纳入个体进行数据和样本收集；筛选阶段信息未记录用于研究用途。
现有监测策略
尼帕病毒感染国家监测系统在孟加拉国各地的哨点医院运行，每个站点涉及两组人员：监测人员（也称为现场工作人员/助理）和监测医师。监测人员负责根据尼帕感染筛查病例定义筛查住院患者的发热和脑/肺部病理症状，而监测医师负责在筛查后核实症状（根据疑似尼帕脑炎和/或疑似尼帕肺炎的病例定义）、获取同意并记录临床信息。监测的病例定义、筛查和纳入程序已由Satter等人详细描述。纳入后，采集口腔拭子和血液，在现场使用严格的生物安全协议进行处理，并在保持冷链的情况下送至达卡的参考实验室。样本送达参考实验室后，血清样本同时进行酶联免疫吸附测定（ELISA）和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），分别检测抗尼帕IgM和NiV RNA。同时，拭子样本仅通过qRT-PCR检测。如果患者样本中检测到NiV RNA或抗NiV IgM，则认为该人尼帕病毒感染阳性。ELISA和qRT-PCR的方法学已通过验证，并由Gurley等人、Lo等人和Rahman等人在已发表文献中详细描述。
研究时间线与地点
尸检监测在五个多月期间（2023年12月至2024年4月）在三个已有尼帕病毒监测的哨点医院进行：拉杰沙希医学院医院（RMCH）、法里德布尔医学院医院（FMCH）和库尔纳医学院医院（KMCH）。选择这些地点是因为现有国家尼帕监测中疑似NiV病例的持续高纳入率以及多年来检测到的大量确诊病例。
尸检监测的关键考虑与研究设置
尸检监测是在现有国家NiV监测系统框架内实施的。利用了监测系统已建立的人员结构、物流和实验室设置；唯一增加的人员是受过富有同情心沟通训练的人类学家。所有其他任务——筛查、临床核实、样本收集和运输以及数据处理——均由现有监测团队执行。这种方法最大限度地减少了额外资源需求，并使新活动能够无缝集成。
筛查合格病例在急诊科以及内科、儿科、神经内科和重症监护室（ICU）等住院病房进行，这些地方最可能发生与尼帕样疾病相关的死亡。这些住院部门已包含在现有存活病例监测中；在我们的研究中，范围扩展到包括符合疑似尼帕感染定义的死者的筛查和纳入。
为适应与悲痛家庭工作的敏感背景，人类学家与陪同死者的人员接触，使用结构化的、经过现场测试的问题收集临床和暴露信息，并获取纳入同意。该策略的灵感来自儿童健康与死亡率预防监测（CHAMPS）研究，该研究证明了熟练沟通在丧亲期间促进同意和数据收集方面的关键作用。
实施过程适应了医院环境的操作现实，包括确认资格、获取同意和在死亡后立即采集样本的有限时间窗口。程序被简化以适应该窗口，同时尊重文化敏感性。为确保样本的安全处理和及时检测以支持公共卫生响应，所有活动均遵循严格的生物安全和生物安全协议进行。筛查、同意和纳入的详细程序在后续部分涵盖。
尸检筛查与纳入（DOA和DAA）
监测工作流程处理两种情况：到达时已死亡（DOA）的患者和入院后（DAA）在能够通过常规监测纳入前死亡的患者。在DOA和DAA两种情况下，均在死亡后不久进行看护者访谈，此时细节仍清晰，从而减少回忆偏倚的可能性。
训练有素的人类学家/监测人员使用经过现场测试的问题进行简短的口头筛查，这些问题在国家尼帕监测系统中已持续使用十多年。筛查侧重于三个领域：（i）导致死亡的疾病期间的发热；（ii）提示脑部受累的神经系统症状/体征（例如，行为不连贯、意识改变或减退、抽搐、新发感觉改变、局灶性运动缺陷）；（iii）提示肺部受累的呼吸道症状/体征（例如，咳嗽、呼吸困难、呼吸窘迫、劳力性气促）。此筛查的唯一目的是评估纳入资格；为符合伦理要求，回答未记录。这种方法借鉴了长期国家监测的经验和实践，确保了准确可靠的数据，同时考虑了悲痛过程。
纳入过程设计为简短且干扰最小，以平衡准确的资格评估与家庭的情感需求。图1总结了此工作流程。
到达时已死亡（DOA）
当死者被带到急诊科时，人类学家筛查与NiV感染一致的症状。如果兼容，则通知主治医师，由其核实症状是否符合疑似尼帕脑炎/肺炎病例定义。如果符合标准，人类学家与家属接触，并在解释研究目标和公共卫生价值后，寻求近亲的书面知情同意以纳入研究。
入院后死亡（DAA）
对于入院后但在监测团队评估前死亡的患者，由现有NiV监测人员（现场助理）进行初步筛查。监测医师通过根据疑似病例定义核实症状来确认纳入资格。如果符合条件，人类学家按照与DOA病例相同的流程从近亲处获取书面知情同意。
仅接近合纳入标准的死者被接洽纳入；不符合标准或无法安全采样的死者未被纳入。
数据收集
对于纳入的病例，仅收集支持病例记录和疫情响应的基本信息，以尽量减少对悲痛家庭的负担。数据收集过程设计为快速，不超过五分钟。记录的变量包括：（i）基本人口统计信息（年龄、性别和居住地），（ii）导致死亡的疾病进展简史，重点关注与疑似尼帕病毒感染一致的症状，以及（iii）与尼帕病毒相关的简要暴露史，包括潜在接触已知风险因素。此外，记录家庭成员或密切接触者中类似疾病的信息以支持快速流行病学评估。数据收集仅在获得书面知情同意后进行。
样本收集、处理与储存
样本类型与原理
口腔拭子是尸检监测收集的唯一样本类型。这是为了确保对死者身体的干扰不超过最低限度，符合文化和社会规范。尽管关于尸检检测尼帕病毒（NiV）在口腔拭子中的人类数据有限，但我们利用了两个证据流：（i）呼吸道RNA病毒（如SARS-CoV-2）在适当储存条件下在咽喉/口腔拭子中的尸检持久性；以及（ii）动物NiV模型显示死亡附近的高病毒载量，支持在接近死亡时检测的生物学合理性。因此，在同意后尽快获取拭子，并记录死亡与样本收集之间的间隔时间以供解释。整个样本收集过程在死者亲属在场下进行以确保透明度。
样本收集程序
在家庭成员在场的情况下，训练有素的监测人员穿着全套个人防护装备（PPE）（防护服、手套、面罩、N95呼吸器）为每个纳入个体收集两个口腔拭子。监测人员站在头部侧面；不进行产生气溶胶的操作（无抽吸/冲洗）。每个无菌尼龙植绒拭子在口腔内轻轻旋转——内颊（颊黏膜）和龈颊沟、舌背以及硬/软腭——约5-10秒；拭子不进入口咽部。拭子立即放入单独的耐低温管中：一个放入裂解缓冲液以稳定RNA用于RT-qPCR，另一个放入病毒运输培养基（VTM）用于潜在交叉检查或额外分析（例如病毒载量估计、基因组测序）。管子盖紧，用70%乙醇擦拭，双层包装，并标有唯一条形码ID和时间戳。在穿戴PPE前和脱卸PPE后（有训练观察员监督脱卸）进行手部卫生，废物丢弃在标记的生物危害容器中，随后根据医院政策进行焚烧。
样本处理、运输与生物安全
在医院站点，处理遵循国家监测SOP，样本在监测站点设置的生物安全柜（BSL-2 plus）中处理，如Satter等人先前所述。在包装前进行2–8°C的短暂临时储存。为运输至One Health Laboratory（icddr,b, Dhaka），样本放入液氮气相干式运输器（≈ ?196°C）中，带有吸收材料和温度监测。运输时间线基于流行病学暴露进行风险分层：如果近亲报告疾病发作前有任何高风险暴露——例如饮用生椰枣汁或发酵汁（tari）、摄入掉落/半吃的果实、与疑似/确诊尼帕患者密切接触，或接触生病动物——样本在收集后24小时内发送，受物流可行性和生物安全限制。在没有此类暴露的情况下，样本遵循常规时间表，根据国家尼帕监测运输协议在收集后72小时内发送。接收后，VTM管在?80°C储存；裂解缓冲液管进行提取，或在2–8°C（≤6小时）或?80°C（如果延迟）保存。
实验室调查
qRT-PCR检测NiV RNA
所有尸检口腔拭子样本均在达卡的icddr,b One Health Laboratory通过实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测尼帕病毒RNA，该检测是国家尼帕监测计划中常规使用的诊断 assay。
使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）按照制造商说明从收集在裂解缓冲液中的拭子样本的140 μL中提取病毒RNA。为减少任何可能的生物安全风险，提取和扩增在专用的生物安全2级（BSL-2）实验室进行，遵循BSL-3实践。
使用CDC验证的引物和探针靶向尼帕病毒的核蛋白（N）基因进行qRT-PCR，如既定方案所述。每次运行均包含阳性对照（质粒对照）和阴性对照（无模板对照和提取空白）以确保 assay 准确性。当检测到扩增且循环阈值（Ct）值低于或等于37时，样本视为阳性，与国家监测系统使用的标准一致。这种方法确保尸检样本的检测完全符合国家和国际公认的尼帕病毒检测诊断标准。
ELISA检测抗尼帕IgM和IgG
在流行病学、疾病控制与研究所（IEDCR），使用US CDC开发和验证的方案进行ELISA检测，通过与美国CDC病毒特殊病原体分支（VSPB）的长期合作，用于孟加拉国的尼帕病毒疫情调查和诊断检测。检测符合CLIA对齐的标准操作程序，如CDC主导的 assay 开发和性能研究所述。
IgM捕获ELISA
使用IgM捕获ELISA检测人抗NiV IgM抗体。微孔板包被抗人IgM抗体以捕获来自疑似病例和接触者收集的经过热和化学灭活的人血清样本中的IgM，进行系列稀释测试。孵育后，向每板的上半部分添加全细胞衍生的NiV抗原（从NiV感染的Vero E6细胞制备并经伽马射线灭活）。同时，板下半部分的相应孔接收模拟感染（未感染）的Vero E6细胞衍生抗原，作为对照抗原。
孵育后，添加含有抗NiV抗体的超免疫小鼠腹水，随后添加HRP标记的抗小鼠IgG/IgM。使用2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）底物显色，使用Epoch2微孔板读取器在414 nm测量光密度（OD）。调整后OD值计算为含NiV感染抗原孔与相应含模拟感染抗原孔之间的差值。
每次ELISA运行均包含阳性对照，该对照由来自1999年马来西亚原始疫情的确诊尼帕病毒病例的人血浆组成，以验证 assay 性能。由于该对照血浆来源于对IgM和IgG均有反应的急性感染，预期性能阈值较高（最低滴度≥1:1600且调整后OD总和≥2.0）。
IgG间接ELISA
使用间接ELISA检测抗NiV IgG抗体。微孔板在4°C下用CDC提供的NiV感染Vero E6细胞裂解液（在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中1:1000稀释）包被过夜。加入经过热和化学灭活的人血清样本进行系列稀释，并在37°C孵育。然后添加HRP标记的抗人IgG，随后进行ABTS底物显色。在414 nm测量OD值，并使用配对的NiV感染和模拟感染抗原孔计算调整后OD值，与CDC开发的方案一致。
解释标准
IgM和IgG ELISA结果的解释遵循CDC VSPB CLIA兼容的标准操作程序。如果最低抗体滴度≥1:400且累积调整后OD总和≥0.45，则样本视为IgM阳性。如果最低抗体滴度≥1:400且累积调整后OD总和≥0.95，则样本视为IgG阳性。这些临界值代表了CDC开发的参考实验室检测中当前的操作标准，并且在数值上不同于反映历史 assay 迭代的早期出版物中报告的阈值。
基因组分析
通过Oxford Nanopore Technology对尼帕病毒RT-qPCR阳性RNA进行全基因组测序，遵循Rahman等人概述的方案。生成的序列数据已存入国家生物技术信息中心（NCBI），登录号为PV132707.1。从GenBank下载了1999年至2024年的几个完整或接近完整的NiV基因组序列，并使用BioEdit v7.2与本研究新测序的NiV阳性病例进行比对。基于完整或接近完整的NiV序列使用MEGA-12（版本12.0.9）软件进行系统发育分析。系统发育树使用最大似然法推断，进行1000次 bootstrap 重复，采用通用时间可逆（GTR）模型以及离散伽马（G）分布和进化不变（I）位点。进化距离使用Kimura 2-parameter计算，在MEGA-12（版本12.0.9）软件中实现。比例尺表示遗传距离，bootstrap值低于70的不显示。
与国家尼帕病毒感染检测和响应工作保持一致
尸检监测活动是作为现有国家尼帕监测计划的延伸进行的，该计划由icddr,b和流行病学、疾病控制与研究所（IEDCR）联合实施。这种整合使得所有程序——从筛查到实验室确认——都遵循与存活病例检测相同的协议。
通过尸检检测任何尼帕病毒阳性病例都会立即报告给IEDCR和医院当局。在任何收集的样本中检测到尼帕病毒都会触发与通过常规监测识别的病例相同的疫情调查和公共卫生响应措施。这些措施包括在家庭和医疗机构进行调查、寻找感染源、接触者追踪和NiV检测，以及实施遏制策略以防止进一步传播。
通过将尸检方法嵌入国家监测网络，确保本试点研究的结果直接为即时响应和未来改进孟加拉国NiV检测和控制的规划提供信息。
结果
时空分布
在研究期间，三个地点共筛查了246例死者。RMCH的筛查数量最高（n = 153），其次是KMCH和FMCH。筛查在1月（n = 58）和2月（n = 60）达到高峰，在4月最低（n = 37）（补充表1）。只有10例个体（10/246；4.1%）符合疑似尼帕病毒病例定义；所有均为入院后死亡（DAA）。5例在KMCH识别，5例在FMCH识别；未从RMCH识别到合格病例（图2）。所有10例符合纳入标准的病例均在获得近亲书面知情同意后纳入。纳入数量最高（6/10）是在2024年3月。
NiV检测结果
在纳入者中，一名来自KMCH站点的死者检测出NiV阳性，占纳入者的10%。通过RT–PCR检测，阳性样本的扩增曲线清晰明确，见补充图1。阳性病例的qRT-PCR Ct值为27.3。相比之下，从2023年12月至2024年4月底，这三个医院的常规存活病例尼帕监测共筛查了40,104名患者。其中，584名合格个体被纳入，一人检测出NiV阳性（约占纳入者的0.2%）。
操作时间线（死亡→纳入→采集→检测）
从死亡到开始接洽获取同意的中位时间为9分钟（IQR：5–23.5分钟）。同意和纳入在宣布死亡后的中位时间15分钟（IQR：10–29分钟）内完成，而NiV阳性病例在死亡后10分钟内被纳入，但有三例阴性死者的时间分别为29和40分钟。完成数据和样本收集的中位时间为10分钟（IQR：9–10分钟），与阳性病例相似，后者持续时间为7分钟。从样本采集到样本检测的中位持续时间为26.0小时（IQR：24.7–52.3），而阳性病例的持续时间较长，为49.0小时，除一例阴性死者持续时间为180.3小时外。对于从死亡到样本检测的总持续时间，阴性病例的中位时间为26.1小时（IQR：24.7–52.3小时），而阳性病例的总持续时间为49.0小时（表1）。
人口统计学、临床和暴露特征
在尸检监测纳入的10例个体中，6例（60%）为男性；中位年龄42.5岁（范围：2–70岁）（表2）。所有病例在死亡前均有发热。死亡前其他常见的临床特征包括意识不清（90%）、抽搐/癫痫发作（80%）和呼吸困难（60%）。其他较少见的症状包括腹泻（20%）、咳嗽（20%）、颈部强直（20%）、精神状态改变（20%）、呕吐（10%）和流涎增多（10%）。在症状出现前的暴露史方面，八例个体（80%）无暴露史，仅一例（10%）有饮用生椰枣汁史，另一例有饮用生棕榈汁（来自棕榈树的生汁）史（表2）。
确诊病例详情
一名来自库尔纳Dacope Upazila的38岁男性因急性神经和呼吸道疾病被转诊至KMCH，并在入院后六小时内死亡（补充图2包含疾病进展详情）。由于入院发生在深夜且患者迅速死亡，他未能在生前通过常规监测接受评估。尸检口腔拭子在死亡后17分钟在获得近亲同意后，在全面PPE下采集。次日，在icddr,b One Health Laboratory通过qRT-PCR确认尸检拭子中存在NiV RNA。
阳性NiV病例的基因组分析
为了将NiV阳性尸检口腔拭子获得的序列置于背景中，我们使用从NCBI GenBank数据库检索的完整和接近完整序列进行了全面的多序列比对和系统发育分析。共识基因组与孟加拉国参考株AY988601.1相比，在100%查询覆盖率下显示出99.0%的核苷酸同一性。在系统发育树中，我们的序列聚集在NiV-BD-2亚系内，与2015年Madaripur疫情的序列（登录号MK673585–MK673586）分组最接近。这种聚类暗示了密切的遗传关系，表明该地区当前流行的毒株可能与2015年先前疫情中识别的毒株有共同祖先。
与AY988601.1相比，我们总共观察到180个单核苷酸多态性（SNP）——114个在编码区，66个在非编码区——在蛋白质编码基因中产生18个非同义氨基酸变化。阳性样本中的病毒RNA载量为6.32 × 106copies/mL，通过使用靶向N基因的质粒对照系列稀释生成的qRT-PCR标准曲线估算。（系统发育树见图3。）
疫情调查与响应
实验室确认后，卫生和家庭福利部（MoHFW）的国家快速反应团队（NRRT）——由IEDCR领导——于当日启动了疫情调查，符合国家尼帕监测和响应SOP。活动包括：（i）指示病例的家庭评估，（ii）沿护理路径的医疗机构追踪，（iii）标准化暴露评估，以及（iv）与地区卫生当局协调进行接触者识别、分类和检测。
密切接触者是指在患者患病期间有直接护理、1米内面对面互动或接触体液的人；同源暴露者共享推测的暴露源（例如同一批次的生椰枣汁）。
调查核实了指示病例在症状出现前约10天饮用生椰枣汁；源树位于家庭附近，有蝙蝠栖息地。共识别出34名密切接触者，包括一名同源暴露者（配偶）。其中，10名密切接触者在疫情调查期间被追踪并采集了血清样本。其余24名接触者，连同先前识别的7名接触者（共31名），在42天随访期间被追踪，并在那时采集了他们的血清样本。疫情调查期间采集的样本通过RT-qPCR和抗NiV IgM检测；未检测到额外的急性感染。所有采集的样本均检测了抗NiV IgG；全部为阴性（补充图3）。NRRT/IEDCR团队在家庭和相关护理场所实施了风险沟通和预防措施。
讨论
我们在常规哨点操作期间，从死亡后几分钟内采集的尸检口腔拭子中检测到尼帕病毒（NiV）RNA，并将这种非侵入性方法嵌入孟加拉国的国家监测和响应工作流程中。先前人类NiV的尸检确认主要依赖于侵入性尸检组织采样（组织病理学、免疫组织化学和组织RT–PCR），而不是在监测内获得的口腔/咽喉拭子，这与马来西亚的经典尸检系列和随后的诊断综述一致。因此，我们的贡献是操作性的：展示了一种可行的、文化上可接受的、非侵入性尸检拭子采集方法，该方法在国家授权内运作，并触发当日的公共卫生响应。
尸检纳入和采样在NiV季节高负担医院中是快速且可接受的：如结果所示（见“操作时间线”和表1），纳入和样本收集在死亡后几分钟内发生，实验室检测随后很快在常规时间表上进行。这种节奏与国家监测SOP和生物安全工作流程兼容——包括现场BSL-2“plus”处理和液氮干式运输器运输——如孟加拉国哨点监测系统所述。这种对齐促进了及时的实验室确认和现场行动，同时保持了文化可接受性和操作安全性。由于死者在死亡后几分钟至几小时内被采样，且许多致命病程迅速，尸检血清学在早期可能不敏感；因此，我们在本试点中优先进行RNA检测，并计划在未来工作中评估尸检血清或口腔液抗体检测的可行性和附加价值。
如结果详述，尸检部分在符合疑似病例定义的死者中识别出一例实验室确诊的致命感染，而同期同一医院的存活病例监测很少检测到阳性。这种对比反映了不
