猪博卡病毒G3基因型首次成功分离及其年龄依赖性致病性研究

《Virulence》：Successful cell culture isolation and experimental pathogenicity evaluation of porcine bocavirus G3

本研究首次实现猪博卡病毒（PBoV）G3基因型毒株（BK19）的体外分离，通过添加胰蛋白酶的LLC-PK1细胞培养系统成功扩增病毒，并系统评估其年龄依赖性致病机制。研究证实PBoV可引发仔猪发热、呼吸道症状及腹泻，且在幼龄仔猪（5-8日龄）中呈现更广泛的组织嗜性及持续病毒脱落，为明确PBoV作为原发性猪病原体的临床意义提供了关键证据。

　　

引言

猪博卡病毒（Porcine Bocavirus, PBoV）属于细小病毒科（Parvoviridae）博卡 parvovirus 属，自2009年在瑞典猪群中首次发现以来，已在全球多个地区流行。其病原性长期未明，主要障碍在于缺乏有效的体外培养系统。本研究通过优化培养条件，成功分离一株中国PBoV G3基因型毒株，并通过动物实验明确其致病性。

病毒分离与鉴定

利用添加2.5 μg/mL胰蛋白酶的LLC-PK1细胞，从湖南地区腹泻仔猪肠道样本中分离到PBoV BK19毒株。病毒在感染后48小时出现细胞圆缩、脱落等典型病变（图1A），透射电镜可见直径20-30 nm的球形病毒颗粒（图1C）。免疫荧光检测证实VP2蛋白在胞质内表达（图1B），噬斑试验显示不规则小斑块形态（图1D）。病毒在96小时达到复制峰值（10^8.73TCID₅₀/mL），且连续传代后滴度稳定（10^8.45–10^8.57TCID₅₀/mL）（图1E-F）。

基因组特征与进化分析

BK19基因组全长5,225 nt，编码NS1、NP1、VP1/VP2蛋白。与参考毒株相比，其全基因组核苷酸一致性为43.4–95.7%，与中国株pig/ZJD/China/2006亲缘最近（95.7%）。系统进化分析确认BK19属于G3基因型（图2），与中国当前流行株高度同源。

动物致病性实验

通过感染5–8、17–19及31–33日龄仔猪，发现所有年龄组均出现发热（>40.5°C）、呼吸急促及腹泻（图3）。幼龄仔猪（5–8日龄）症状最严重，100%发热、80%呼吸道症状、60%腹泻（表2）。病理检查显示小肠壁变薄透明、肺实变、淋巴结出血及肾脏点状出血（图5）。组织学可见肠绒毛上皮脱落、肺泡炎性浸润及淋巴细胞耗竭（图6）。

病毒动力学与组织分布

幼龄仔猪直肠拭子病毒载量在4 dpi达峰值（10⁶–10⁷copies/mL），持续检出至14 dpi（图4A）。14 dpi时，5–8日龄仔猪多组织（脑、肺、淋巴结、肠道等）均检出病毒，而31–33日龄组组织病毒阴性（图4B），提示年龄影响病毒清除能力。

免疫组织化学与细胞增殖

仅在5–8日龄仔猪肠黏膜、肺间质、淋巴结及肾小管中检测到PBoV抗原（图7）。Ki-67染色显示感染组小肠与肺部细胞增殖显著增强（p<0.01）（图8），表明病毒可能促进宿主细胞复制。

讨论与展望

本研究突破性地建立了PBoV体外分离技术，证实G3基因型对仔猪的年龄依赖性致病性，尤其幼龄猪更易出现多组织感染和持续排毒。局限性在于未完全排除其他肠道病毒共感染可能，且大日龄组排毒数据缺失。未来需利用无菌猪模型进一步解析PBoV独立致病机制，为防控提供理论依据。