《Emerging Microbes & Infections》：HA Protein acetylation modulates replication, pathogenicity, and immunogenicity of influenza virus and facilitates live-attenuated vaccine design
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本研究发现H1N1流感病毒血凝素（HA）蛋白存在4个新型乙酰化位点（K157、K169、K418、K459），通过反向遗传学构建模拟去乙酰化（K→R）和持续乙酰化（K→Q）的突变病毒，证实乙酰化修饰动态调控HA蛋白pH稳定性，进而影响病毒致病力。其中K418R突变株作为减毒活疫苗候选株展现出完全保护效力，为流感疫苗研发提供了新思路。
乙酰化修饰位点的发现与验证
通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，研究团队首次在H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株的血凝素（HA）蛋白上鉴定出4个赖氨酸乙酰化位点：K157、K169、K418和K459。为了确认每个位点均可独立发生乙酰化，研究人员构建了仅保留单个天然赖氨酸位点（其余三位点突变为精氨酸Arg）的重组病毒。Western Blot结果显示，四种单赖氨酸突变体的HA蛋白均能被乙酰化抗体识别，证实了每个位点均可独立发生乙酰化修饰。进一步的保守性分析揭示，K459（位于HA2茎部结构域）在H1N1、H1N2和H5N1亚型中高度保守（>92%），提示其功能可能具有普适性；而K169和K418的保守性呈现亚型特异性，暗示其功能可能与特定亚型的宿主适应或抗原性调控相关。
乙酰化状态对病毒复制效率的影响
利用反向遗传学技术，研究团队成功拯救了8种HA乙酰化状态模拟突变病毒：分别模拟去乙酰化状态（K157R、K169R、K418R、K459R）和持续乙酰化状态（K157Q、K169Q、K418Q、K459Q）。在MDCK细胞中的病毒生长动力学实验表明，去乙酰化模拟突变体（K→R）的复制效率普遍低于野生型病毒（WSN-WT），其中K157R突变体在感染后12小时和24小时的病毒滴度显著降低。在持续乙酰化模拟突变体（K→Q）中，K418Q毒株在24小时的复制水平甚至高于野生型，而其他突变体复制效率则有所下降。Western Blot检测显示，病毒HA蛋白表达水平与病毒滴度总体相关，但部分突变体（如K157Q与K418Q）的复制动力学差异提示HA的翻译后功能也影响复制效率。这些结果表明HA蛋白的乙酰化修饰状态是调控流感病毒复制效率的关键因素。
乙酰化修饰动态调控病毒对小鼠的致病力
动物致病性实验结果显示，所有去乙酰化模拟突变病毒（K157R、K169R、K418R、K459R）对小鼠的毒力均显著弱于野生型。值得注意的是，K157R和K418R突变体感染后小鼠全部存活（100%存活率），且体重下降轻微；而K169R和K459R则分别导致50%和70%的死亡率。与之形成对比的是，持续乙酰化模拟突变体K157Q和K418Q能够完全恢复病毒毒力，其致病性与野生型相当，导致100%死亡率。然而，K169Q和K459Q却未能恢复毒力，依然表现为显著减毒。这一发现表明，K157和K418位点的乙酰化对于病毒毒力至关重要，而K169和K459位点则可能需要乙酰化与去乙酰化的动态循环（而非持续乙酰化状态）来维持其正常功能。肺部病毒载量检测显示，在感染后3天，K157R组的病毒滴度显著低于K157Q组，K418R组也显著低于K418Q组，进一步印证了这些位点乙酰化状态对早期病毒复制的关键调控作用。
组织病理学与炎症反应特征
对感染后3天的小鼠肺组织进行组织病理学分析发现，野生型病毒（WSN-WT）感染引起严重的肺泡塌陷、上皮细胞损伤和中性粒细胞浸润。K157R突变体导致的病变较轻，肺泡结构清晰，上皮细胞损失适中。令人惊讶的是，K418Q突变体引起的病变甚至比野生型更严重，表现为细支气管和肺泡严重出血、管腔内坏死细胞脱落以及血管周围和支气管周围大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润。与之相反，K418R感染组的病理损伤则显著减轻。免疫组织化学（IHC）染色检测病毒核蛋白（NP）抗原分布显示，野生型感染小鼠的支气管和肺泡区域存在广泛的NP抗原阳性信号，而K157R和K418R感染组的NP抗原信号则明显减少。细胞因子mRNA表达水平分析揭示，减毒突变体K157R和K418R在感染后3天和5天诱导了显著高于野生型的干扰素-β（IFN-β）和干扰素-γ（IFN-γ）表达。IFN-γ作为重要的抗病毒细胞因子，能够调节先天性和适应性免疫，其高水平表达可能与这些减毒株诱导的更强宿主免疫应答有关。同时，K157R和K418R也诱导了更高水平的抗炎因子白细胞介素-10（IL-10），这可能有助于减轻感染引起的过度炎症反应，从而与观察到的毒力减弱表型相关。
病毒形态与出芽效率
利用电子显微镜（EM）观察病毒形态发现，除了K157R突变体显示出病毒出芽效率显著降低外（单位长度细胞膜上的出芽病毒粒子数量减少），其他突变病毒产生的子代病毒粒子在形态（球形和丝状）上与野生型没有显著差异。这一结果说明，K157位点的乙酰化对于病毒的有效出芽至关重要，而其他位点的乙酰化修饰对病毒颗粒的形态建成影响相对较小。
受体结合特性与pH稳定性的关键作用
受体结合实验表明，所有突变病毒均保持与野生型相同的受体结合特异性，即优先结合α-2,6连接的唾液酸（宿主适应性受体）。然而，在结合亲和力上存在差异：位于HA受体结合域150-loop上的持续乙酰化模拟突变体K157Q和K169Q，对α-2,6唾液酸的结合能力显著强于野生型。有趣的是，尽管K169Q具有更强的受体结合能力，其毒力却表现为减毒，这提示病毒致病性并非仅由受体结合亲和力决定，其他因素如膜融合效率可能更为关键。通过合胞体形成实验评估HA蛋白的pH稳定性发现，野生型病毒的膜融合触发pH值为5.7。毒力与野生型相当的K157Q和K418Q突变体，其融合pH值也为5.7。而减毒的K157R、K418R和K459Q突变体则需要更高的pH环境（pH 5.9）才能触发融合，表明其HA蛋白的酸稳定性增强（即激活阈值升高）。相反，毒力减弱的K169Q和K459R突变体的融合pH值则更低（pH 5.5），意味着其HA蛋白在更酸性的环境中才发生构象改变。这些结果清晰地表明，HA蛋白的乙酰化修饰通过精细调控其pH稳定性来影响病毒致病力，过高或过低的融合pH值都会导致毒力减弱，只有处于最佳范围的pH稳定性（如野生型的pH 5.7）才能支持病毒的完全毒力。
减毒病毒株作为疫苗候选的评估
基于上述致病性研究结果，研究人员选取了毒力显著减弱的K157R、K169Q和K418R突变体作为候选减毒活疫苗进行评价。小鼠免疫实验表明，这三种疫苗候选株均非常安全，接种后无死亡发生。K418R免疫组小鼠甚至未出现明显的体重下降。血清学分析显示，免疫后14天，所有免疫组小鼠均成功产生血清转化，其中K157R免疫组诱导的血凝抑制（HI）抗体滴度最高（平均达11 Log2），表现出良好的免疫原性。在用致死剂量的野生型病毒攻击后，所有免疫组小鼠均获得完全保护（100%存活），且肺部检测不到病毒载量（检测限为101TCID50），而未免疫攻击组小鼠全部死亡。攻击后14天，免疫组小鼠仍维持高水平的HI抗体滴度。病理学检查也证实免疫组小鼠肺部无明显病变。综合安全性和免疫效果，K418R突变体因其最佳的安全性，以及K157R突变体因其出色的免疫原性，成为非常有前景的流感减毒活疫苗候选株。
讨论与展望
本研究系统阐明了流感病毒HA蛋白上四个特定赖氨酸位点（K157, K169, K418, K459）的乙酰化修饰在调控病毒复制和致病力中的关键作用。其分子机制涉及对病毒出芽效率、受体结合亲和力，尤其是HA蛋白pH稳定性的精细调控。研究首次将HA的乙酰化这一蛋白质翻译后修饰（PTM）与流感病毒的致病性直接联系起来，并创新性地提出了通过调控特定位点乙酰化状态来设计减毒病毒疫苗的策略。K418R和K157R减毒株的成功验证为未来流感疫苗的研发开辟了新的途径。该研究的局限性在于使用赖氨酸到谷氨酰胺（K→Q）的突变来模拟持续乙酰化状态，谷氨酰胺并非乙酰化赖氨酸的完美结构类似物，可能会引入天然修饰所没有的立体效应或成键效应。然而，K157Q和K418Q能够完全恢复病毒毒力，且其复制能力和受体结合能力增强，有力地支持了在这些特定位点，Q突变较好地模拟了乙酰化状态。而对于K169和K459位点，其功能可能更依赖于乙酰化/去乙酰化的动态循环，而非简单的持续乙酰化状态。未来的研究可进一步探索宿主细胞内的乙酰转移酶（KATs）和去乙酰化酶（HDACs）如何动态调控病毒HA蛋白的乙酰化状态，从而深化对病毒-宿主相互作用的理解。
