《Applied Phycology》：Optimising pretreatment methodologies to improve the use of nuisance macroalgal biomass from bloom Ulva spp. prior to enzyme hydrolysis for downstream processing and application
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本综述系统探讨了如何通过优化预处理方法（包括洗涤、脱水和干燥等步骤）来提高石莼（Ulva spp.）生物质的质量，特别是其碳水化合物含量，从而显著增强后续酶水解（如使用ulvan lyase和cellulase）释放还原糖（如鼠李糖rhamnose和葡萄糖glucose）的效率。研究为利用有害藻华生物质提供了可行的预处理方案，对实现生物资源（如生物燃料、生物化学品）的可持续开发具有重要意义。
摘要
石莼（Ulva spp.）作为一种大型绿藻，在全球范围内的生物资源应用中正受到越来越多的关注。本研究旨在优化将石莼生物质分离为其还原糖组分的工艺流程，涵盖了原料获取、洗涤、预处理以及酶糖化等多个环节。研究首先从有害藻华中收集了野生管状石莼物种，并通过含量分析确定了碳水化合物相对于生物质干重的丰度。通过自来水洗涤循环确定了最佳洗涤条件，六次洗涤后盐度相比初始野生石莼组成降低了97.6%。后续试验使用了商业化养殖的裂片石莼（U. lacinulata），通过比较螺旋压榨和电动沙拉脱水器技术，试验了去除多余水分（脱水）的方法。结果表明，电动沙拉脱水器批量脱水的效率更高，并且比螺旋压榨脱水后保留了显著更高的碳水化合物。采用不同温度的烘箱干燥和冷冻干燥进行的比较干燥显示，冷冻干燥比在较低温度下烘箱干燥的生物质保持了显著更高的碳水化合物丰度，总体碳水化合物产率最高。随后评估了石莼质量及其对酶法释放糖类（糖化）的影响。在使用内部ulvan lyases和商业混合纤维素酶（cellulases）进行酶糖化之前，将冷冻干燥的裂片石莼样品在不同温度下进行高压灭菌（autoclave）预处理。经90°C预高压灭菌处理的生物质通过ulvan lyases释放出最大量的鼠李糖和其他还原糖，而120°C是纤维素酶驱动葡萄糖释放的最佳条件。将裂片石莼在室温空气中放置0-72小时，然后使用这些最佳预高压灭菌条件进行高压灭菌和酶降解。观察到糖产量的显著差异，较长的降解时间通常导致释放的还原糖量降低。这些发现共同为开发和优化处理与利用石莼生物质（包括来自藻华的生物质）的有效方法，以用于进一步的生物加工应用做出了贡献。
引言
石莼（Ulva，绿藻门）是一种全球分布的绿色大型海藻属，在多种不同的医疗、工业和有机产业中具有广泛的应用。石莼物种对广泛盐度的适应性和韧性使其能够在沿海区域，无论是海洋还是河口生态系统，都旺盛生长，甚至达到形成持续性藻华的程度。石莼物种已被研究作为生态健康的生物指示剂，在爱尔兰和其他欧洲国家的研究利用石莼来评估与欧盟水框架指令一致的水质。来自农业、水产养殖、工业废物和家庭废物的人为营养输入可能促进或延长石莼物种的藻华，导致缺氧分解。缺氧分解的增加也会导致水中氧气耗竭，影响物种生存，并随后释放含硫化合物气体。这导致水流和降雨中的酸度升高，并影响水中硫酸盐和硝酸盐之间的离子交换和自然平衡。随着石莼藻华频率和强度的增加，寻找这种资源的市场引起了相当大的兴趣。然而，由于这些藻华的原因归因于多种外部来源，如污染、污水排放以及过度使用富含硝酸盐和磷的动物粪便，这个问题没有简单的解决方案。利用生物质可能不可行，因为石莼能够生物积累有害金属，可能对人类和动物健康构成担忧。相反，为了保护当地环境，产生“绿潮”的藻华通常被清除，这需要大量的经济投入来妥善处理过量且受污染的大型海藻。然而，通过预处理，许多这些限制得以消除，并且随着对用于生物加工的替代性、可持续生物质的需求不断升级，大型海藻已被用于生物燃料、生物化学品、生物炭、生物塑料等。石莼物种的组成约为5–27%蛋白质、0.5–4%脂质、13–50%灰分和53–78%碳水化合物。该属中主要的多糖是ulvan、淀粉、纤维素、半纤维素和葡萄糖醛酸。Ulvan是最复杂的，根据物种不同，占干重的9–36%。它是一种硫酸化多糖，由源自鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸等单糖的重复二糖单元组成。由于ulvan的低水溶性和被限制在细胞壁内，其提取提出了显著的挑战。这种独特的碳水化合物在其他物种中未被发现，意味着对酶法提取的研究比其它更常见的多糖更为有限。现有文献显示，石莼物种生物质的组成和质量因所应用的预处理而异。Poeloengasi等人关于收获后洗涤和干燥过程的研究表明，用自来水浸泡最长时间（3小时）的生物质灰分百分比最低（17.46%）。扫描电镜分析发现随着时间的推移细胞壁降解增加，导致叶状体变得越来越脆。该研究还比较了日光干燥和50°C烘箱干燥，发现日光干燥在干燥过程及后续储存中均导致加速变色，证实了Martone等人的报道。烘箱干燥保持了生物质的外观，尽管与此过程相关的能源和成本较高。稳定化处理也影响了关键细胞壁多糖ulvan的提取率。Robic等人表明，ulvan的最高产率来自在70°C下烘箱干燥的生物质。次高产率来自冷冻干燥的石莼；然而，高能量需求和能源单位的成本将显著影响商业可行性。由于石莼中存在多种多糖，将这些分子水解成更简单、可用的糖是一项复杂的任务。多糖的提取率不仅受预处理、提取温度、颗粒大小和持续时间的影响；还受物种以及由于生态生理学差异引起的种群变异的影响。生物化学转化的酶机制需要较少的能量和化学品，但酶通常昂贵或难以获得。由于石莼多糖的结构变异及其可及性，需要不同的酶来水解它们，几项研究已经表征和评估了ulvan lyase酶及其将ulvan降解成更短的寡糖和二糖链的适用性。如果这些酶能够以高活性表达，它们可以在比热化学过程中更低的能量和经济需求下使用，并且更容易用于转化途径，从而提高藻类生物质在未来中的潜力。本研究基于这些文献，报告了如何优化收获后过程以增强生物质用于下游过程，最大化材料的碳水化合物含量。考察的方面包括：1）使用不同的洗涤和干燥程序；2）热预处理对后续酶水解的影响；以及3）模拟降解的藻华石莼，在处理和应用基于上述的热预处理之前，如何改变酶糖化产率。试验始于藻华来源的石莼物种，但由于后勤困难无法在后期试验中使用。相反，在后续的优化试验中使用了冷冻的培养裂片石莼。
方法
石莼来源和初始储存
三公斤管状石莼物种于2023年6月19日从威尔士彭布罗克郡泥滩（北纬51.73183度，西经4.87102度）收集，分成1公斤批次，并在4°C下储存过夜。该地点的材料先前已通过分子鉴定为浒苔（U. prolifera），但由于从野外采集的性质，可能存在其他物种，因此此处使用了石莼物种的命名法。由ALGAplus（葡萄牙伊利亚沃）养殖的叶片状裂片石莼于2022年11月7日收获并冷冻。在运输至阿伯里斯特威斯及随后储存期间，它一直保持在-20°C，在使用前以小批量（最多500克）在室温下解冻。
洗涤方法学和盐浓度测定
将三批各1公斤的石莼物种（来自威尔士彭布罗克郡）分别放入装有4.0升室温自来水的桶中（生物质与水比例1:4）。搅动生物质，取出并用手挤掉多余水分。从每批中取100克湿大型藻类和50毫升沥干液体中的水样。剩余的生物质然后用淡水反复洗涤并再次取样。每次洗涤使用的水量是剩余批次重量的四倍。对每批进行了十次洗涤过程。所有大型藻类样品随后被冷冻、冷冻干燥并研磨用于含量分析。使用多参数电导率探头测量水样的电导率，并使用公式（1）转换为盐度：实用盐度 = (0.7317 * 电导率) – 3.7635，其中电导率以毫西门子/厘米为单位。
脱水方法学
由于脱水对石莼样品上残留沉积物的依赖程度低于洗涤研究，因此在本研究及后续研究中使用了来自葡萄牙的商业裂片石莼。在本实验中，将3.0公斤生物质在室温下解冻，然后分成六份500克的生物学重复。三个500克重复样品分别在BORNKU沙拉脱水器中以3075 g离心10秒，以下称为电动脱水器技术。从大型藻类脱出的液体中取10毫升水样，固体再以3075 g离心10秒。重复旋转直至脱水器底部不再观察到水。脱水后的裂片石莼被冷冻、冷冻干燥，并使用IKA A11研磨机研磨，然后储存在自封袋中，置于黑暗、凉爽的环境下，以待分析。三个500克重复样品分别使用双齿轮榨汁机进行螺旋压榨。保留10毫升压榨液体，收集切碎的生物质，并通过粗棉布挤压以去除多余水分。剩余的生物质被冷冻、冷冻干燥并研磨，然后储存在自封袋中，置于黑暗、凉爽的环境下，以待分析。
干燥方法学
将另外1.2公斤裂片石莼在室温下解冻，然后在电动脱水器中旋转直至无法提取更多液体。称重生物质，分成100克批次重复样品，并分别在40°C、50°C、60°C和70°C的烘箱中，在金属托盘上以2.5厘米的厚度进行三重干燥。在24小时观察生物质并翻转（将风干面朝下，先前底面朝上）以确保完全干燥；40°C和50°C的样品总共干燥48小时，60°C和70°C的样品在26小时后干燥。干燥样品研磨后储存在自封袋中，置于黑暗、凉爽的环境下，以待分析。
含量分析以确定碳水化合物数量
对所有按照不同洗涤、脱水和干燥方法收集的样品进行了含量分析。碳水化合物含量计算为从生物质重量中扣除水分、灰分、脂质和蛋白质含量后的剩余固体，基于先前发布并经过论证的方案。简而言之，生物质水分含量使用AOAC方法930.15，灰分含量量化紧随其后使用AOAS方法923.03。粗蛋白含量的测定采用杜马斯燃烧法，使用Vario MAX Cube CN分析仪，并使用转换因子6.25将总氮转化为粗蛋白含量。粗脂肪含量的评估按照AOCS方法AM 5–04执行，使用ANKOM XT-15脂肪提取器。
酶学研究预处理和糖化
将1克重的冷冻干燥裂片石莼（来自葡萄牙）样品称重放入250毫升锥形瓶中，然后悬浮于 either 100毫升100 mM Tris缓冲液（pH 8.5）用于ulvan糖化研究；或50 mM柠檬酸缓冲液（pH 5.0）用于纤维素酶研究。用棉塞塞住瓶口并用箔纸覆盖，然后使用高压灭菌锅在60°C、90°C或120°C下高压灭菌60分钟。将这些样品冷却并用于酶糖化研究，同时设有一组未加热（20°C）样品，如果需要，在糖化前将样品在4°C下储存过夜。
Ulvan糖化
重组ulvan lyase酶4144和4173，从Alteromonas sp. 76–1克隆，按照先前描述的方式进行过表达和纯化。向每个用Tris缓冲液预处理的锥形瓶中加入500 μl AUL 4144（对应308 μg）和500 μl AUL 4173（对应23 μg）；然后将锥形瓶在30°C、180 rpm下在摇床培养箱中孵育24小时。从每个样品中取出15毫升等分试样，并使用离心机在3100 g下离心10分钟。取出上清液并在还原糖分析前储存在-20°C。
纤维素酶糖化
向每个用柠檬酸缓冲液预处理的锥形瓶中加入过量的180 μl（相当于推荐添加量的3倍）商业可得的纤维素酶混合物Cellic? CTec3；然后将锥形瓶在30°C、180 rpm下在摇床培养箱中孵育24小时。从每个样品中取出15毫升等分试样，并使用离心机在3100 g下离心10分钟。取出上清液并在还原糖分析前储存在-20°C。
3,5-二硝基水杨酸（DNS）测定
基于Miller（1959）的DNS测定法，按比例缩小以便使用酶标仪进行定量，用于测定糖化后释放的还原糖。将250 μl DNS试剂加入2 ml微量离心管中，其中含有250 μl来自酶糖化步骤的水解石莼上清液。将溶液在干式恒温器加热块中加热至100°C持续10分钟，然后在冰上转移2分钟。取出200 μl此溶液并移液到96孔板中，然后在酶标仪上于540 nm波长下读取。葡萄糖和鼠李糖的系列稀释液以及空白样品也以三重重复运行，以便应用标准曲线和基线扣除来确定每个过程的单糖值。
降解大型藻类以模拟绿潮
将360克来自葡萄牙的裂片石莼生物质解冻并分成四批，每批90克。然后将每批分成9个培养皿（每皿10克）。将这些培养皿放在朝南的窗台上放置0、24、48或72小时。在每个时间段后，将培养皿合并，然后将每批分成三份。这三份中的每一份分别使用120毫升（每次洗涤）室温自来水洗涤六次，在电动脱水器中以3075 g离心3个循环（每个循环10秒），冷冻干燥后研磨成粉末。然后将此粉末加入相关缓冲液中，并用于对每种酶进行上述酶糖化步骤。
降解裂片石莼的热预处理和糖化
降解裂片石莼的方法如上所述，只是ulvan lyase糖化仅使用90°C的最佳预处理条件，纤维素酶糖化试验仅使用120°C。
统计分析
基本数据操作和图表在Microsoft Excel中生成。使用IBM SPSS进行数据的统计分析。对所有数据进行单因素方差分析及随后的Tukey事后检验，以确定组间在95%显著性水平下的显著差异。
结果
洗涤循环优化和盐浓度测定
通过多次洗涤和部分干燥石莼物种样品，确定了从这些样品中去除盐分所需的最少洗涤次数。结果显示第一次洗涤后盐度迅速下降，基于所有三个重复批次平均值的趋势线确定盐度在第6次洗涤时趋于稳定。对第1次和第6次洗涤的石莼物种样品进行了含量分析，测量了灰分、粗脂肪和蛋白质；碳水化合物通过差值法确定。这使得可以比较各组分之间的比例，并判断碳水化合物在洗涤过程中是否不成比例地损失。含量分析组分的相对比例显示，在第1次和第6次洗涤的材料之间，灰分比例相对减少，脂肪和蛋白质含量增加。然而，在正态性检验后，单因素方差分析显示，只有蛋白质通过洗涤显著增加，碳水化合物的比例在过程之间没有显著差异，表明在此过程中没有显著的碳水化合物损失。
脱水优化
标准化的脱水过程既能产生更一致的湿生物质用于分析，又可能影响生物质的物理组成。使用两种不同的脱水设备，螺旋压榨机和电动脱水器，处理湿裂片石莼样品，并分析其灰分、脂肪和蛋白质组成，碳水化合物如前所述通过差值法确定。由于本研究使用培养的裂片石莼，其灰分含量（10.7%）低于图中（使用藻华石莼物种），使得这些数字不能直接比较。在初始正态性检验后，进行方差分析，结果显示除蛋白质量外，两种干燥方法对所有组分均具有统计学显著性。由于后续加工需要高碳水化合物含量，电动脱水器在加工后显示的碳水化合物含量显著高于螺旋压榨机，因此在后续试验中使用了电动脱水器。
干燥过程
为了评估干燥条件，将解冻的裂片石莼样品使用电动脱水器脱水，然后在不同温度（40、50、60、70°C；冷冻干燥）下干燥。这些不同干燥方式样品的组成如图所示。应用单因素方差分析及Tukey检验（p < 0.05）识别具有显著差异的组。冷冻干燥生物质得到的样品中碳水化合物比例最高，但与60°C或70°C干燥的样品比例无显著差异。此外，冷冻干燥样品显示出高度均匀的结果，标准偏差小，因此被选用于后续试验。
通过DNSA测定量化的酶糖化
通过电动脱水和冷冻干燥制备的裂片石莼样品经过热预处理后，使用ulvan水解酶或纤维素酶进行糖化。表1显示了预处理后释放糖的平均值。方差分析显示，在不同预处理温度下制备的样品中，ulvan lyases释放的还原糖量存在显著差异（p < 0.05）；使用混合纤维素酶在不同预处理温度下释放的糖量也存在显著差异（p < 0.001）。加入ulvan lyases后，先前在90°C下高压灭菌的裂片石莼释放出最高量的鼠李糖和其他还原糖（77.79 mg g–1）。相比之下，加入纤维素酶后，糖的释放与温度升高直接相关，最高量来自先前在120°C下高压灭菌的石莼（188.31 mg g–1）。
降解大型藻类以模拟绿潮藻华
将裂片石莼的重复批次放置降解长达72小时，然后通过电动脱水、冷冻干燥和研磨进行处理。样品随后在90°C和120°C下高压灭菌，冷却，并使用ulvan lyases混合物或纤维素酶混合物进行糖化。表2显示了降解后释放糖的平均值。方差分析显示，ulvan lyase糖化后的结果存在显著差异（p < 0.001），纤维素酶糖化后的结果也存在显著差异（p < 0.001）。ulvan lyase糖化后还原糖的最高量出现在新鲜（未降解，0小时）样品中（109.75 mg g–1），最低出现在降解48小时的样品中（95.37 mg g–1）。纤维素酶糖化后，还原糖的最高量出现在降解0和24小时的样品中（161.93 – 163.17 mg g–1），最少出现在降解48和72小时的样品中（115.03 – 124.67 mg g–1）。总之，这表明大型藻类降解时间越长，释放的葡萄糖越少。
讨论
生物质洗涤循环优化
在进行洗涤试验时，确定4:1的水与生物质比例足以确保大型藻类完全浸没，而不会浪费过多的水。结果突出显示，在第6次洗涤循环后盐度达到稳定，平均盐度为94.8 ppm，与第一次洗涤循环相比减少了98%。较低的盐度是有益的，因为多项研究已确定它会降低酶糖化的效率。对第1次和第6次洗涤的成分分析突出了冲洗过程引起的变化。具体而言，观察到在第6次洗涤中，灰分含量在洗涤过程中降低了8.1%，粗脂肪增加了0.8%，蛋白质增加了5.0%，碳水化合物增加了2.3%，相对于第1次洗涤材料的组成。第6次洗涤的灰分含量为43.7%，仍然相当高，特别是与本研究中使用的培养裂片石莼的灰分含量（10.7%）相比。文献指出石莼物种的灰分含量通常在1.8–38%之间。由此可以假设，即使在六次洗涤后，石莼生物质上或内部仍然存在某种形式的残留淤泥或沙粒污染。虽然进一步的洗涤可以减轻这种污染，但人们担心对生物质结构完整性的潜在影响，以及在此过程中碳水化合物损失的相关增加。还需要考虑后续洗涤所需的额外水量、时间和能量。
生物质脱水
脱水步骤的机械化是必要的，以确保生物质在干燥前具有标准化的、降低的水分含量；有助于保持干燥时间并产生更均匀的结果。脱水研究比较了电动脱水器和螺旋压榨机，目的是确定是否有任何机器影响生物质的组成，同时保持可持续和可重复的过程。脱水后，灰分含量略高于初始灰分含量（螺旋压榨为14.3%，电动脱水器为11.5%），这是由于脱水过程中水溶性化合物随水被去除，但基于先前文献显示了更典型的组成含量表示。螺旋压榨机的碳水化合物百分比低于电动脱水器（电动脱水器计算为55.6%，螺旋压榨为53.8%），这被确定为显著（p < 0.05）。这种变化是由于榨汁过程中使用的机制造成的。螺旋压榨机磨损大型藻类以“榨汁”材料，影响生物质的结构完整性以形成压榨饼。这种方法会导致较大的细胞碳水化合物和其他物质在过程中在果汁部分损失，正如其他大型藻类研究中所见。相比之下，电动脱水器在视觉上保留了石莼物种的结构，在细胞内包含了更多的碳水化合物。
生物质干燥
石莼物种的最佳干燥方法在相关文献中各不相同，根据需要提取的化合物，通常使用40°C至70°C的范围。先前一项关于石莼物种的研究，考虑了最大化碳水化合物产率的最佳干燥温度，指出当使用更高的烘箱干燥温度（最高测试温度为60°C）时，ulvan的回收率增加。本研究发现了类似的结果，冷冻干燥给出了最高比例的碳水化合物，但紧随其后的是，并且在统计上无差异，是在60°C和70°C下烘箱干燥。这些结果与Robic等人的发现相似，他们从在70°C下干燥的材料中提取的ulvan产率高于在50°C下干燥的材料。当观察这种比例变化如何影响含量分析的其他组分时，可以看到粗脂肪的减少部分反映了碳水化合物的增加。使用烘箱干燥方法，材料中的脂肪酸可能由于在较高温度下发生的挥发而减少；冷冻干燥也会损害植物材料中的脂质。在干燥时间较长和/或温度较高的方法中也观察到蛋白质降解，但并未影响本研究中检测到的蛋白质百分比。
酶糖化的预处理
通过高压灭菌进行生物质预处理有助于分解细胞壁，使糖更容易被酶接触，变性酶抑制剂，并使生物质均匀分布在溶液中。使用ulvan lyases和纤维素酶，这些试验评估了随后释放的还原糖浓度，这些被认为主要是鼠李糖和木糖（来自ulvan lyase）和葡萄糖（来自纤维素酶）。由于酶最佳条件的差异，两种酶在平行研究中独立进行比较。预处理生物质能够显著影响使用两种酶从石莼生物质中释放的还原糖量。表1显示，在90°C下预处理60分钟的生物质使得ulvan lyase释放的还原糖浓度最高。相比之下，纤维素酶释放的最高糖浓度发生在120°C预处理之后。较高的高压灭菌温度更可能破坏和分解细胞壁及其他结构分子，暴露纤维素并使其更容易被酶水解。这些结果得到了类似研究的支持，这些研究发现糖释放量在120°C左右预处理的宏藻生物质上最高。
大型藻类降解
这项研究的下一步是将从制定优化方案中获得的知识应用于降解的石莼生物质，以模拟由过度藻类潮汐产生的绿潮冲刷到岸上的材料。将裂片石莼在室温下降解，然后洗涤6个循环，使用电动脱水器脱水，冷冻并冷冻干燥。然后将研磨的材料在相关缓冲液中，针对ulvan lyases在90°C下高压灭菌60分钟，或针对纤维素酶在120°C下高压灭菌。冷却后，进行酶糖化，并通过DNSA测定测量还原糖的存在。表2表明，新鲜、未降解的大型藻类（0小时）在ulvan ly
