《Journal of Inflammation Research》：CYBB-Mediated Ferroptosis Drives Podocyte Injury in Lupus Nephritis and Represents a Therapeutic Target
编辑推荐：
本研究揭示了CYBB（细胞色素b-245β链）介导的铁死亡（ferroptosis）是狼疮性肾炎（LN）足细胞损伤的关键机制。通过整合MRL/lpr小鼠模型、体外足细胞实验及人类肾小球转录组数据，证实CYBB上调通过促进活性氧（ROS）生成和脂质过氧化驱动铁死亡，而CYBB敲低或铁死亡抑制剂Fer-1可逆转损伤。该研究为LN提供了新的治疗靶点。
狼疮性肾炎中的铁死亡激活与足细胞损伤
研究背景指出，系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，狼疮性肾炎（LN）是其最严重的表现之一，影响高达60%的SLE患者，是终末期肾病（ESRD）的主要病因。足细胞损伤是LN蛋白尿和肾功能恶化的关键决定因素。铁死亡是一种铁依赖的调节性细胞死亡形式，与肾脏疾病相关，但其在LN中的作用尚不清楚。
MRL/lpr小鼠在16周时表现出明显的肾炎特征
通过连续评估肾功能，发现MRL/lpr小鼠出现进行性肾功能恶化。与8周龄MRL/lpr小鼠相比，12周龄小鼠的24小时尿蛋白（24h-UP）、血清肌酐（SCr）和抗双链DNA（anti-dsDNA）抗体水平轻度升高，但24h-UP和SCr的差异未达到统计学显著性。到16周时，24h-UP、SCr和抗dsDNA抗体水平显著升高，表明这些小鼠出现明显的肾功能损害。将8周龄MRL/lpr小鼠定义为SLE组（代表无明显肾损伤的早期狼疮阶段），16周龄MRL/lpr小鼠定义为LN组，同龄C57BL/6小鼠作为对照（Con）组。此外，还包括一组接受铁死亡抑制剂Fer-1治疗的16周龄MRL/lpr小鼠作为Fer-1组。评估各组24h-UP、SCr和循环抗dsDNA抗体水平显示，SLE小鼠24h-UP和抗dsDNA抗体轻度升高，SCr无显著变化。相比之下，LN组所有三个参数均较对照组显著升高，证实了肾炎的建立。Fer-1治疗改善了肾功能和自身抗体水平，表现为蛋白尿减少、SCr降低和抗dsDNA抗体滴度下降。
铁死亡在肾炎进展过程中被激活并被Fer-1抑制
通过测量铁含量、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）等关键生化标志物评估肾脏中的铁死亡活性。与对照组和SLE组相比，LN组小鼠肾脏铁含量和MDA水平显著升高，GSH水平显著降低。蛋白质印迹分析进一步显示，LN肾脏中铁死亡相关的抗氧化蛋白GPX4和SLC7A11显著减少。Fer-1治疗部分恢复了GSH水平，减少了MDA积累，使肾脏铁含量正常化，并增加了GPX4和SLC7A11的表达。
Fer-1治疗改善LN小鼠的肾损伤并保留肾功能
H&E、PAS和Masson三色染色组织学分析显示，LN小鼠出现明显的肾小球硬化、肾小管上皮坏死和间质炎症，而对照组和SLE组肾脏结构基本保留。Fer-1组这些病理改变显著减轻，肾小球和肾小管形态改善，间质损伤减少。半定量评分显示，与对照组相比，LN小鼠系膜增生、毛细血管内增生和新月体形成评分显著升高，而Fer-1治疗显著降低了这些评分。采用4-羟基壬烯醛（4-HNE）免疫组织化学染色评估氧化性脂质损伤。LN肾脏肾小球和肾小管区室均显示强烈的4-HNE积累，Fer-1治疗后这种积累显著减少。4-HNE染色评分的定量分析证实了这些观察结果，显示LN组评分显著高于Con组和SLE组，而Fer-1治疗显著降低了评分。
足细胞损伤与LN中的铁死亡活性相关
由于足细胞损伤是LN蛋白尿的核心驱动因素，评估了各实验组的足细胞完整性。蛋白质印迹分析显示，对照组和SLE组nephrin和podocin表达得以维持，但LN小鼠中表达显著降低，表明严重的足细胞损伤。一致地，免疫荧光染色显示LN小鼠肾小球中podocin显著丢失，而Fer-1治疗显著恢复了podocin表达并维持了足细胞结构。为了进一步研究铁死亡与足细胞损伤之间的关系，进行了GPX4和podocin的共定位分析。LN小鼠在足细胞丢失区域GPX4表达减少，而Fer-1治疗恢复了这两种信号，表明抑制铁死亡与保留足细胞完整性相关。
LN血清暴露在体外促进铁死亡相关的足细胞损伤
为了在体外模拟LN的病理环境，用LN小鼠血清处理分化的MPC5细胞。与用对照血清处理的细胞相比，暴露于10% LN血清48小时的足细胞显示nephrin和podocin显著下调，表明结构和功能损伤。此外，细胞内铁积累、ROS产生和脂质过氧化（MDA）显著升高，而抗氧化防御能力，如GSH含量、GPX4和SLC7A11表达显著降低。这些改变表明暴露于LN血清的足细胞中铁死亡过程被激活。为了研究铁死亡的作用，在LN血清暴露前用铁死亡抑制剂Fer-1预处理足细胞。Fer-1显著减轻了铁超载、ROS生成和脂质过氧化，同时恢复了GSH水平并上调了GPX4和SLC7A11表达。Fer-1预处理还保留了nephrin和podocin表达，表明减轻了足细胞损伤。这些结果证明LN小鼠血清直接诱导足细胞中铁死亡相关损伤，并且铁死亡的药理学抑制对此损伤提供细胞保护作用。
整合转录组分析确定CYBB为人狼疮性肾炎肾小球中铁死亡相关枢纽基因
为了表征疾病相关的转录变化，分析了包含32个LN和14个对照肾小球样本的肾小球表达数据集GSE32591。差异表达分析识别出299个差异表达基因（DEGs），包括235个上调和64个下调转录本。前50个可变基因的热图显示LN组和对照组明显分离，反映了强大的疾病相关转录重编程。功能富集分析显示，上调的DEGs与免疫激活强烈相关，富集于核因子κB（NF-κB）和Rap1信号通路等通路，并涉及细胞因子反应和白细胞活化等生物过程。相反，下调的DEGs主要富集于代谢通路，包括氨基酸和精氨酸生物合成，以及细胞外应激反应通路。
接下来，应用基于网络的方法识别LN相关基因。加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别出两个主要基因模块，其中蓝色模块与LN状态相关性最强（相关系数r = 0.85）。从该模块中，选择了81个枢纽基因用于后续分析。同时，最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归将DEG集缩减为13个具有非零系数的候选基因，代表LN的潜在预测标志物。与FerrDb V2中筛选的207个铁死亡驱动基因整合，确定CYBB为唯一重叠的候选基因。进一步分析证实，与对照组相比，CYBB在LN肾小球中显著上调。这些发现将CYBB确定为与LN肾小球损伤潜在相关的铁死亡相关枢纽基因。
LN中CYBB表达上调加剧足细胞铁死亡
基于生物信息学预测和体内铁死亡表型，接下来研究了LN足细胞中CYBB的表达及其功能作用。免疫组织化学分析表明，与同龄对照组相比，早期（8周）和已确诊LN（16周）的MRL/lpr小鼠肾脏CYBB表达显著上调。
由于生物信息学分析确定CYBB是LN中关键的铁死亡相关基因，且铁死亡导致LN小鼠足细胞损伤，进一步在体外检查了CYBB在足细胞中的功能作用和潜在机制。用靶向CYBB的siRNA或过表达质粒转染足细胞，并通过qPCR和蛋白质印迹证实转染效率。比较LN、NC-siRNA+LN（阴性对照siRNA）和OE-NC+LN（空载体对照）组之间的GSH和MDA水平，未发现显著差异。因此，选择LN处理的细胞作为后续蛋白质印迹分析的对照组。
CYBB敲低显著减轻了LN血清诱导的铁死亡反应，表现为ROS和MDA水平降低，同时GSH和GPX4表达恢复。Nephrin和podocin表达相应保留。相反，CYBB过表达增强了氧化应激、铁死亡表型和足细胞结构蛋白丢失。
在CYBB过表达后，用Fer-1预处理一组足细胞2小时，然后在含有10% LN血清的培养基中培养48小时。与暴露于LN血清的CYBB过表达组相比，Fer-1预处理恢复了GPX4、nephrin和podocin表达，增加了GSH含量，并降低了ROS和MDA水平。这些结果表明CYBB对LN足细胞损伤的加剧作用至少部分通过铁死亡介导。
讨论
本研究证明铁死亡是LN足细胞损伤的核心机制，并确定CYBB是将氧化应激与铁死亡性细胞死亡联系起来的关键上游调节因子。使用狼疮易感MRL/lpr小鼠和足细胞培养，观察到狼疮性肾炎以铁积累、脂质过氧化、谷胱甘肽耗竭以及GPX4和SLC7A11等关键抗氧化防御下调为特征。Fer-1的药理学抑制保留了足细胞完整性，减少了蛋白尿，并改善了肾脏病理。此外，CYBB作为一个枢纽基因，在人类LN肾小球中持续上调，其功能调节直接影响足细胞的铁死亡易感性。这些发现支持铁死亡作为LN发病机制的潜在贡献者，并提示CYBB作为一个值得进一步研究的候选调节因子。
转录组分析确定CYBB为在狼疮性肾炎患者肾小球中持续上调的铁死亡相关基因。功能实验证实，在狼疮小鼠肾脏和暴露于狼疮血清的足细胞中CYBB表达增加。机制上，CYBB过表达增强了活性氧的产生，加剧了脂质过氧化，并加重了足细胞的铁死亡性损伤，而CYBB敲低或Fer-1治疗逆转了这些效应。这些发现将CYBB定位为铁死亡介导的足细胞损伤的关键驱动因子，并表明CYBB介导的氧化应激构成狼疮性肾炎进展的重要机制。
CYBB基因编码NOX2，它是NADPH氧化酶复合物的催化亚基，负责在呼吸爆发期间产生超氧化物。在生理条件下，CYBB衍生的ROS在抗菌防御和免疫调节中起关键作用，特别是在中性粒细胞和巨噬细胞中。然而，CYBB的过度或持续激活将ROS产生从保护性转变为致病性，放大氧化应激并促进组织损伤。除了在ROS生成中的作用外，CYBB/NOX2还可能通过激活核因子κB（NF-κB）等通路整合氧化还原和炎症信号，从而加剧局部炎症并增强足细胞的铁死亡易感性。
LN的特点是肾脏内存在明显的氧化应激状态，这有助于肾小球损伤和疾病进展。NOX2在包括足细胞在内的肾小球细胞中表达，研究观察到其在狼疮受累肾组织中的水平升高。浸润的免疫细胞如中性粒细胞和巨噬细胞由于其NOX2活性也是ROS的有效来源。这些浸润免疫细胞的持续激活在肾小球内建立了持续的促氧化环境，促进脂质过氧化和氧化损伤。这种免疫细胞衍生的氧化应激可放大邻近足细胞中的脂质过氧化，从而加剧铁死亡性损伤。浸润白细胞和常驻肾细胞之间的这种串扰表明炎症和氧化途径的汇聚，加剧了狼疮性肾炎中的足细胞功能障碍和肾损伤。
这项研究有几个重要的局限性需要承认。首先，所有实验均在狼疮易感小鼠和永生化足细胞中进行，这可能不能完全重现人类狼疮性肾炎的复杂性。因此，需要在患者活检组织和原代人类足细胞中进行验证。其次，虽然我们确定CYBB是足细胞铁死亡的关键调节因子，但本研究未系统探讨其在其他肾脏区室和浸润免疫细胞中的更广泛作用。鉴于CYBB/NOX2在宿主免疫防御中的生理作用，特别是在中性粒细胞介导的病原体清除中，靶向CYBB的治疗策略必须仔细平衡疗效与潜在的免疫抑制风险。
总之，研究结果表明铁死亡可能是狼疮性肾炎足细胞损伤的关键因素，CYBB可能作为将氧化应激与铁死亡性细胞死亡联系起来的上游调节因子。
