《Journal of Inflammation Research》：Ginsenoside Rg3 Mitigates LPS-Induced Injury in Human Bronchial Epithelial Cells by Restoring Autophagic Flux and Inhibiting the TLR4/NF-κB-Mediated Inflammatory Response
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本文综述了人参皂苷Rg3（G-Rg3）在脂多糖（LPS）诱导的人支气管上皮细胞（HBE）损伤中的保护作用及机制。研究发现G-Rg3通过双重机制发挥保护效应：一方面恢复被LPS破坏的自噬流（autophagic flux），下调自噬相关蛋白（ATG4B、ATG7、PIK3C3、p62、LC3B-II）的表达；另一方面抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路活化，显著降低促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8）的分泌，并有效减轻细胞凋亡/坏死。该研究为G-Rg3作为靶向自噬与炎症交叉对话的潜在治疗剂，用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）和急性肺损伤（ALI）等呼吸系统疾病提供了新的实验依据。
引言
作为传统中药的基石，人参（Panax属）因其广泛的治疗作用而被长期研究和表征，包括免疫调节、抗氧化和抗炎作用。人参皂苷是人参的主要活性成分，包括40多种结构不同的类型，分为原人参二醇（PPD）和原人参三醇（PPT）皂苷。人参皂苷Rg3（G-Rg3）是一种PPD型微量人参皂苷，富含于红参中，通过蒸制和干燥新鲜人参根制成。由于其强大的生物活性，包括抗癌、抗炎和抗凋亡作用，G-Rg3引起了显著关注。然而，大多数关于G-Rg3对呼吸损伤保护作用的研究集中于全身炎症或动物模型，对其在人支气管上皮（HBE）细胞——呼吸道的前线屏障——中的直接调节作用探索有限。
慢性阻塞性肺疾病（COPD）、急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）常伴有过度、失控的炎症和上皮细胞死亡。在研究中，脂多糖（LPS）作为革兰氏阴性细菌细胞壁的结构成分，被广泛用于模拟细菌感染和诱导炎症反应，尤其是在气道上皮细胞中。LPS在吸入或全身给药时可激活Toll样受体4（TLR4），导致促炎细胞因子过度产生，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6和IL-8。过度自噬或自噬流受损（自噬流阻断；自噬体-溶酶体融合受损）会加剧炎症和细胞死亡。上述促炎介质是上皮损伤、血管通透性增加及随后呼吸系统并发症的关键贡献者。
自噬是一种高度保守的细胞降解过程，已被证明在应激条件下调节炎症和细胞存活。该过程导致双膜自噬体的合成，其与溶酶体融合，降解受损的细胞器和蛋白质。在正常生理条件下，自噬维持稳态；在病理条件下，失调的自噬可加剧细胞损伤或促进凋亡。积累的证据表明，LPS调节自噬活性，并且在支气管上皮细胞中，可能发挥保护或有害作用，具体取决于背景和剂量。例如，一些研究报告称适度的自噬水平有助于阻断细菌清除和细胞存活。此外，过度或阻断的自噬流可能导致细胞毒性和炎症。
根据最近的研究，天然化合物（如人参皂苷）据报道可调节自噬和炎症信号通路。特别是，G-Rg3可以抑制LPS刺激的巨噬细胞和上皮细胞中的核因子κB（NF-κB）信号传导和细胞因子释放。此外，在动物模型中，G-Rg3通过抑制氧化应激和减少中性粒细胞浸润，显示出对LPS介导的急性肺损伤的保护作用。另外，其抗凋亡作用已在小鼠心肌细胞、肝细胞和肾小管细胞中得到证实，主要通过调节PI3K/Akt/mTOR和AMPK通路。
LPS在人支气管上皮（HBE）细胞中通过促炎、上皮屏障破坏过程诱导自噬和凋亡；然而，G-Rg3在此过程中的调节作用尚不清楚。虽然研究已证明G-Rg3在巨噬细胞和癌细胞中具有抗炎作用，但G-Rg3及其对自噬相关蛋白ATG4B、ATG7、LC3B和p62以及PIK3C3的调节对气道上皮的影响尚属未知。理解这种关系非常重要，因为上皮细胞死亡和炎症是管理呼吸系统疾病的关键靶点。
方法
细胞培养
人支气管上皮（HBE）细胞（ATCC, Cat# CCL-202）被用作体外模型。细胞处理和文化条件受到严格控制以确保实验一致性。
试剂和抗体
人参皂苷Rg3（G-Rg3，纯度≥98%）购自TargetMol（Cat# T3402），溶解在二甲基亚砜（DMSO；Sigma, Cat# C6628）中制备成10 mM储备液，储存于-80°C。大肠杆菌055:B5来源的脂多糖（LPS）购自Solarbio（Cat# L8880），用无菌PBS（Solarbio, Cat# P1020）重悬成1 mg/mL储备液，通过0.22 μm无菌滤器（Millipore, Cat# SLGP033RB）过滤，储存于-20°C。自噬抑制剂阳性对照氯喹购自Sigma（Cat# RNBH9960），用PBS制备成50 mM储备液，储存于4°C。
蛋白质印迹分析
如 [](@replace=1)所示，为研究不同浓度LPS如何调节HBE细胞中的自噬，我们评估了自噬相关蛋白的表达。代表性蛋白质印迹条带显示，与对照（0 ng/mL LPS）相比，LPS处理随着其浓度升高（1–100 ng/mL）逐渐增加了ATG4B、ATG7、PIK3C3、p62和LC3B条带的灰度强度。定量分析进一步证实LPS以浓度依赖性方式显著上调这些蛋白的相对表达（相对于β-肌动蛋白归一化）。这些结果表明LPS以浓度依赖性方式上调自噬相关蛋白表达，同时抑制HBE细胞中自噬溶酶体的形成。
细胞凋亡测定
细胞凋亡使用Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒（Elabscience, Cat# E-CK-A211）和流式细胞术进行定量。将HBE细胞以每孔6×105个细胞的密度接种在6孔板中，培养24小时（直至达到70-80%汇合度），然后用含有相应处理的新鲜完全DMEM更换培养基。处理后，收集细胞，用Annexin V-FITC和PI染色，并使用流式细胞仪进行分析。
PI染色检测细胞死亡
碘化丙啶（PI）染色用于评估坏死或晚期细胞死亡。将HBE细胞接种在预灭菌的盖玻片上，用相同的实验组处理24小时。处理后，细胞用含PI和Hoechst 33342的共染色溶液染色，并在倒置荧光显微镜下观察。
ELISA细胞因子定量
酶联免疫吸附测定（ELISA）用于定量HBE细胞培养上清液中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8）的水平。使用人特异性ELISA试剂盒，按照制造商方案进行检测。
统计分析
所有实验独立重复至少三次，数据以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。
结果
LPS可激活自噬同时抑制自噬流
如图1所示，LPS以浓度依赖性方式上调自噬相关蛋白的表达，同时p62和LC3B-II的积累表明自噬底物清除受损。这些结果提示LPS增强自噬相关蛋白的表达以促进自噬囊泡形成和成熟；同时，p62和LC3B的同步升高表明LPS也抑制自噬体与溶酶体的融合，从而阻断自噬溶酶体形成。
Rg3有效拮抗LPS诱导的自噬激活
G-Rg3对LPS刺激的HBE细胞具有显著的调节作用。为了阐明其功能，我们首先用100 ng/mL LPS联合梯度浓度的G-Rg3（0, 2, 4, 8, 16 μM）处理HBE细胞，并检测自噬相关蛋白的表达。如图2A-D所示，与单独LPS组（0 μM G-Rg3）相比，G-Rg3以剂量依赖性的方式降低ATG4B、ATG7、PIK3C3和p62的表达，其中16 μM G-Rg3观察到最显著的下调。这些结果证实G-Rg3有效减弱LPS诱导的自噬相关蛋白上调，从而缓解由过度自噬激活引起的病理变化。
为了进一步探讨G-Rg3的时间依赖性效应，我们用100 ng/mL LPS加16 μM G-Rg3处理细胞不同时间（0, 2.5, 6, 9, 12, 30 h）：图2B及其定量图2D显示，随着处理时间延长，LC3B和p62的表达水平逐渐降低（在较晚时间点显著降低）。这表明G-Rg3对LPS诱导的自噬的抑制作用随着暴露时间延长而逐渐增强。
人参皂苷Rg3有效拮抗LPS介导的自噬激活诱导的细胞死亡
为了进一步研究LPS对细胞活力的影响以及随后与Rg3共同处理的影响，我们用LPS、G-Rg3或两者组合处理细胞24小时。处理后，细胞用碘化丙啶（PI）染料染色，并通过荧光倒置显微镜观察红色荧光强度。结果显示，与对照组相比，G-Rg3处理的细胞红色荧光没有显著增加。相反，LPS处理的细胞呈现明显的红色荧光增加。而LPS和G-Rg3共同处理显著降低了红色荧光强度（图3A）。流式细胞术进一步证实LPS组比对照组显示出更大的细胞死亡。而LPS+G-Rg3组显示细胞死亡减少（图3B）。这些发现强调了LPS促进细胞死亡，而G-Rg3有效减轻了它。
Rg3人参皂苷抑制LPS诱导的细胞炎症因子水平升高
为了阐明G-Rg3对LPS诱导的炎症因子水平的影响，我们采用ELISA比较了LPS刺激的HBE细胞在G-Rg3处理前后这些因子的浓度。结果表明，与对照组相比，LPS组促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8的水平显著升高。相反，G-Rg3+LPS组显示这些因子显著下调（图4A-E）。因此，G-Rg3有效减少了LPS诱导的促炎因子释放。
讨论
我们的研究表明，G-Rg3对自噬的调节、对炎症的抑制以及对细胞死亡的缓解并非孤立的平行事件，而是涉及协调的相互作用，既有因果联系，也有互补的独立机制：首先，LPS诱导的自噬流受损作为上游病理驱动因素——失调的自噬不仅破坏细胞稳态，还促进促炎介质的过量产生并加剧导致凋亡/坏死的细胞应激，而G-Rg3恢复自噬平衡（通过下调ATG4B/ATG7/PIK3C3和减少p62/LC3B-II积累）直接减轻了这一上游触发因素，从而有助于其抗炎和抗细胞死亡作用。其次，G-Rg3还通过抑制LPS激活的TLR4/NF-κB信号通路来抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8）的分泌，从而发挥独立的抗炎作用——这是一种与自噬调节平行并与之协同增强对HBE细胞损伤保护的机制。
LPS众所周知可诱导促炎细胞因子的产生，包括TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-2和IL-8，这些因子参与上皮功能障碍和急性肺损伤。我们的研究结果与早期观察结果一致，即G-Rg3通过阻断NF-κB转位来防止LPS诱导的小胶质细胞炎症反应。这些发现共同凸显了G-Rg3在不同细胞类型中广泛的免疫调节潜力。
此外，本研究揭示LPS在HBE细胞中诱导的自噬并非纯粹保护性的，而是致病性的，尤其是当自噬流不完全时。除了自噬体清除受损（这在经受内毒素应激的肺泡上皮细胞中有报道）外，自噬还损害p62和LC3B-II的积累。不完全自噬可能是一把双刃剑：它最初旨在降解受损组分，但如果受阻，最终会导致炎症和细胞死亡。G-Rg3处理降低了自噬相关标志物的表达，表明G-Rg3可能并非完全关闭自噬，而是恢复其平衡。
这些实验揭示G-Rg3显著减轻了凋亡，如流式细胞术和PI染色所确定。LPS诱导的肺损伤与气道上皮凋亡相关，这也与增加的氧化应激和线粒体功能障碍紧密相关。尽管我们的研究未测量ROS水平或线粒体膜电位，但先前的研究表明G-Rg3通过增强抗氧化酶活性和线粒体完整性来减少氧化损伤。
此外，G-Rg3介导的促炎细胞因子释放的抑制。TNF-α、IL-1β和IL-6不仅是炎症的标志物，还作为组织重塑、纤维化和上皮-间质转化（EMT）的组成部分。这些细胞因子在慢性气道疾病（哮喘和COPD）中持续升高。有趣的是，据报道G-Rg3处理可降低纤维化肺模型中的IL-6和TGF-β，表明G-Rg3也可能有助于抑制EMT和气道重塑。
另外，G-Rg3可能影响自噬和炎症之外的信通路。最近的报告表明G-Rg3激活Nrf2/ARE通路，导致抗氧化基因的上调，包括HO-1和NQO1。肺部依赖此通路进行细胞防御氧化应激。例如，Nrf2激活与自噬调节相关，表明G-Rg3可能通过连接分子节点在两个方面发挥作用。此外，G-Rg3调节SIRT1和AMPK，这两个是自噬、炎症和衰老的相反能量传感器。
结合G-Rg3已知的多靶点药理效应，我们推测其对LPS诱导的HBE细胞损伤的保护作用可能通过协同调节一个复杂的信号网络来介导，涉及潜在的分子靶点，如糖皮质激素受体（GR）、组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）和PI3K/AKT/mTOR通路——已知在抗肿瘤和抗炎背景下受G-Rg3调节。
这些发现是有前景的，但我们必须承认局限性。这是一项体外研究，避开了体内肺生理学的复杂性。此外，G-Rg3的药代动力学和肺生物利用度了解甚少。因此，G-Rg3未来在体内肺炎症模型、G-Rg3的药代动力学研究以及调查G-Rg3是否与现有皮质类固醇或支气管扩张剂具有协同效应应是未来研究的重点。本研究的最后一个局限性是对G-Rg3直接分子靶点的机制研究深度不足。
结论
本研究发现人参皂苷Rg3（G-Rg3）减轻了脂多糖（LPS）诱导的人支气管上皮（HBE）细胞自噬失调、促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8）释放和细胞死亡。这些结果为进一步探索G-Rg3在呼吸炎症性疾病中的作用提供了初步基础。
