《Journal of Inflammation Research》：Integrated Bioinformatic Analysis of the Shared Molecular Mechanisms Between Diabetic Nephropathy and Atherosclerosis
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本综述通过整合生物信息学分析，揭示了糖尿病肾病（DN）与动脉粥样硬化（AS）共享的分子机制，重点聚焦于细胞因子-细胞因子受体相互作用等炎症免疫通路。研究筛选出ID4、RNF213和PRCP三个关键共享诊断标志物，其中PRCP在患者外周血中显著高表达，展现出良好的临床诊断潜力，为DN并发AS的早期干预提供了新的靶点和策略。
摘要
背景 越来越多的证据表明，糖尿病肾病（DN）患者发生动脉粥样硬化（AS）的风险显著高于普通人群。然而，这种关联背后的确切机制尚不清楚。本研究旨在探索这一并发症中涉及的共享通路和潜在生物标志物。
方法 研究利用从基因表达综合库（GEO）数据库下载的微阵列数据，识别DN和AS中的差异表达基因（DEGs）。应用加权基因共表达网络分析（WGCNA）来识别与DN和AS相关的共表达模块。对共享基因进行了功能通路富集分析。利用支持向量机（SVM）和最小绝对收缩和选择算子（LASSO）方法来识别和验证潜在的诊断标志物。此外，还进行了免疫浸润分析，以检验DN和AS的核心标志物与免疫浸润细胞表达之间的关系。最后，收集患者血液样本来评估PRCP的诊断效能。
结果 共同基因分析结果显示，免疫和炎症反应，特别是细胞因子-细胞因子受体相互作用，可能是DN和AS病理生理学的共同特征。鉴定并验证了三个潜在的共享诊断标志物——ID4、RNF213和PRCP。免疫浸润分析显示，ID4、RNF213和PRCP的表达与免疫细胞群的变化相关。外周血微阵列数据的差异分析表明，只有PRCP在AS和DN样本中均显著过表达。此外，qRT-PCR证实了患者外周血单核细胞（PBMCs）样本中PRCP的表达增加。
结论 RNF213、PRCP和ID4的共表达可能促进AS和DN的发展。特别是PRCP，由于其作为蛋白质在外周血中可被检测，显示出作为诊断标志物的潜力。
引言
糖尿病（DM）日益增长的患病率是全球范围内一个紧迫的公共卫生问题。预计到2030年，全球将有6.43亿人患有糖尿病，到2045年这一数字将上升至7.83亿。当前研究表明，DM是心血管疾病（CVD）的主要风险因素，而CVD也是2型糖尿病（T2DM）患者发病和死亡的主要原因。
DN是DM主要的微血管并发症之一。由于长期高血糖导致肾小球高滤过和肾小管间质损伤，其表现为蛋白尿增加和肾小球滤过率进行性下降，可能导致终末期肾衰竭。AS是一种以脂质沉积、炎症反应和纤维化为特征的动脉壁疾病。研究证明DN和AS之间存在可能的联系。动脉粥样硬化性血脂异常是DN发生和发展的重要因素。降低动脉粥样硬化性脂质和脂蛋白可以减少肾小球损伤，并减缓或阻止估算肾小球滤过率（eGFR）的下降，从而减少CVD相关疾病和死亡。相反，DN患者血浆血脂异常恶化，蛋白尿和肾功能不全的结合可以增加糖尿病人群中动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的可能性。这些发现加深了我们对血脂与肾功能不全之间联系的理解，并可能有助于发现两种疾病之间的分子机制。
细胞因子是一组小分子，作为各种病理生理反应的介质。它们不仅在调节免疫反应中起关键作用，还参与炎症性疾病的发病机制。一些细胞因子引起的血流动力学变化导致肾小球内压力增加，随后趋化因子诱导炎症细胞进入肾脏，导致免疫介导损伤的放大。最后，诸如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等因素可通过凋亡直接损伤肾小球、系膜和上皮细胞。
ID4主要位于细胞核，RNF213在细胞质中，而PRCP在囊泡中，后者可作为蛋白质在血浆中检测到。先前研究发现，这三个因子都参与代谢紊乱引起的血管内皮损伤、炎症反应和纤维化过程。ID4被证明以细胞特异性方式作为促分化或抗分化因子，调节间充质干细胞（MSC）中的脂肪酸摄取、甘油三酯合成/储存和MSC分化。RNF213干预血管生成，影响脂肪代谢和炎症，并参与动脉粥样硬化斑块形成。目前认为PRCP通过其酶活性和肽转换参与代谢紊乱，白细胞和血浆对循环PRCP活性贡献最大，其中PRCP依赖性信号与细胞因子的密切关系似乎在炎症中起重要作用。PRCP调节摄食和胰岛素受体底物1（IRS1）稳定性，并可通过血管紧张素1-7（Ang 1-7）-MAS受体介导的一氧化氮反应诱导肾脏氧化应激。同时，α-黑色素细胞刺激素（α-MSH）存在于动脉粥样硬化斑块中，PRCP可切割α-MSH以减少巨噬细胞胆固醇外流，间接抑制黑皮质素受体活化并形成泡沫细胞，促进炎症和斑块形成。
虽然有充分证据表明AS和DN之间存在联系，但它们的共同发病机制和病理生理学仍不完全清楚。因此，识别AS和DN的共同诊断标志物对于早期干预有AS风险的DN患者具有巨大的临床意义。
材料与方法
转录组数据预处理 研究使用关键词“diabetic nephropathy”和“atherosclerosis”对GEO数据库进行了广泛搜索。选择标准要求使用PBMCs或组织进行测序。确定了源自肾小球的DN组数据集（GSE96804，41个DN样本和20个正常样本）和源自动脉粥样硬化斑块及邻近组织的AS组数据集（GSE43292，32个AS样本和32个正常样本）。为了增强使用已识别共同标志物的临床预测能力，还纳入了两个基于外周血的数据集：GSE142153（23个DN样本和10个正常样本）和GSE20129（48个AS样本和71个正常样本）。
诊断标志物预筛选 组织数据集GSE96804和GSE43292使用limma包进行差异基因表达筛选，截断标准为调整后P值（P.adj）<0.05且|log2折叠变化（LogFC）|>0.5。对于WGCNA，两个数据集的整个表达谱作为输入矩阵，使用1到30的软阈值范围进行拓扑计算以确定最佳阈值。然后利用拓扑重叠矩阵对相关模块进行分类，每个模块包含至少50个基因，并合并相似模块。最后，使用Pearson方法确定合并模块与疾病发生之间的相关性，选择具有最强正相关的核心模块作为结果。
诊断标志物筛选 通过合并来自GSE96804和GSE43292数据集的共同DEGs与WGCNA中鉴定的交集基因，形成表达矩阵。SVM是一种使用特征向量识别最优核心基因的机器学习方法。LASSO构建惩罚函数以优化模型进行基因选择。疾病发生被视为分类变量，并使用SVM和LASSO选择标志物。
富集分析 对来自GSE96804和GSE43292数据集的DEGs以及WGCNA中鉴定的交集基因进行合并，并使用clusterProfiler包进一步富集。进行了基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。上述基因还使用Metascape数据库进行了模块富集分析，以识别具有类似功能的基因簇。
核心诊断标志物定位分析 查询人类蛋白质图谱数据库以确定ID4、RNF213和PRCP的细胞内定位，并评估它们是否是分泌蛋白。
免疫浸润分析 利用CIBERSORT算法，通过评估与免疫细胞相关的基因表达水平来确定各种免疫细胞类型的比例。基于22种浸润免疫细胞的输出结果，分析核心标志物与免疫浸润细胞之间的相关性采用Spearman方法。
临床验证 研究招募了5名DN患者、5名AS患者和5名健康人，收集外周血并提取PBMCs。总RNA使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2提取。使用HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR Kit从分离的RNA合成cDNA。使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix Kit在ABI7500实时PCR系统上进行qRT-PCR。引物序列为PRCP-F: AGCTTCTGCCCCTATCTGG, PRCP-R: GCACTGATTACATTTCCC, GAPDH-F: CAATGTGGACCGCTTTTCCTA, GADPH-R: GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。结果通过2?ΔΔCt方法计算。
结果
差异基因筛选 在DN数据集中，鉴定出1199个DEGs，其中438个上调，761个下调。AS数据集产生1071个DEGs，包括608个上调和403个下调基因。最终，AS和DN数据集揭示了207个重叠的DEGs。
WGCNA构建与模块分析 在AS数据集中识别并移除一个显著异常值，在DN数据集中识别并移除两个显著异常值。AS数据集的最佳软阈值确定为25，DN数据集的最佳软阈值确定为5。通过分析模块相似性，在AS和DN数据集中分别识别出16个模块。棕色模块与AS表现出最强的正相关性（r=0.58），而红色模块与DN具有最强的正相关性（r=0.83）。最终，在WGCNA结果中发现37个重叠基因。
共享基因与共享通路鉴定 结合DEGs和模块基因进行富集分析。KEGG分析显示在细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞粘附分子和Rap1信号通路等通路中显著富集。GO富集分析显示在生物过程如白细胞迁移、细胞粘附的正向调节和白细胞细胞-细胞粘附中显著富集。在细胞组分类别中，在含胶原的细胞外基质（ECM）、分泌颗粒膜和粘着斑中显著富集。对于分子功能，在酰胺结合和信号受体激活剂活性中观察到显著富集。使用Metascape数据库将这些基因富集成模块，揭示了五个不同的模块：细胞生长的调节、与MHC II类分子相关的生物过程、血浆脂蛋白颗粒水平的调节、肥胖中的IL1和巨核细胞以及NABA核心基质。
潜在共享诊断标志物的鉴定与验证 使用机器学习算法选择最具诊断价值的枢纽基因。在AS数据集中，SVM方法鉴定出13个基因，LASSO方法选择出5个基因。在DN数据集中，SVM方法鉴定出19个基因，LASSO方法选择出15个基因。比较每个数据集中不同方法选择的基因，发现了三个共同的诊断标志物：ID4、RNF213和脯氨酰羧肽酶（PRCP）。定位研究显示ID4主要位于核质，RNF213位于胞质溶胶，PRCP位于囊泡。值得注意的是，PRCP是血浆中可检测的蛋白质，可用于临床检测。
共享诊断标志物的免疫相关性分析 使用基于22种免疫细胞的CIBERSORT方法研究免疫浸润模式。在AS和对照样本中，幼稚B细胞、记忆B细胞、CD8 T细胞、活化记忆CD4 T细胞、调节性T细胞（Tregs）和活化NK细胞存在显著差异，而静息树突状细胞也显示出显著差异。在DN数据集中，记忆B细胞、CD8 T细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、静息树突状细胞、静息肥大细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞观察到显著变化。相关性分析显示，在AS数据集中，ID4与M0巨噬细胞呈强正相关，PRCP与活化NK细胞呈正相关，RNF213与静息CD4记忆T细胞呈正相关。在DN数据集中，PRCP也与浆细胞、静息NK细胞等呈正相关。
共享诊断标志物的验证 分析显示，在AS组织数据集中，ID4在正常样本中过表达，而RNF213和PRCP在AS样本中高表达。这种表达趋势在DN组织数据集中也观察到。对外周血微阵列数据进行差异分析，结果表明PRCP在AS和DN样本中显著更高。AS和DN队列中的受试者工作特征（ROC）分析证实了PRCP的强大诊断能力。此外，对我们患者血液样本的qRT-PCR测试表明，AS样本和DN样本中的PRCP表达显著高于正常样本。研究结果表明，RNF213、PRCP和ID4共表达的破坏可能有助于DN和AS的发展。此外，外周血测试结果表明，PRCP可能具有良好的诊断能力，并可在临床环境中使用。
讨论
本研究深入探讨了DN和AS在遗传水平上的病理生理联系。通过实施WGCNA和DEG分析，发现免疫和炎症反应相关功能可能在DN和AS的发展中具有重要意义。对公共疾病数据库中共同基因的富集分析也揭示了细胞分化和炎症信号通路的富集。可以推断，由免疫和炎症反应产生的炎症环境可能是两种疾病的共同特征，细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路可能在它们的共同发病机制中发挥重要作用。
DN本质上是一种表现为肾脏局部炎症的代谢紊乱，主要特征是由于ECM过度沉积，导致基底膜增厚、系膜扩张和肾小管间质纤维化。微炎症和随后的ECM扩张是DN进展的共同途径，有证据表明炎症是DM微血管并发症发生之前的首要促进因素。诸如核因子κB（NF-κB）等转录因子可被高血糖激活，以调节与炎症和ECM转换相关的基因。在DN中，蛋白尿本身是NF-κB的重要激活剂，也是肾小管细胞重要的促炎刺激物。此外，炎症细胞因子如IL-1、IL-6、IL-18和TNF也在DN的发病机制中起关键作用。氧化应激产生生物活性分子，修饰低密度脂蛋白（LDL），消耗一氧化氮，导致内皮功能障碍，产生各种氧化反应物和自由基扩散，最终加剧DN血管损伤。一些免疫细胞，包括B和T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞和中性粒细胞，在DN中发生显著改变并进入肾脏参与糖尿病肾损伤。
泡沫细胞是AS的标志，动脉粥样硬化斑块是CVD的主要病理基础。脂质分子，特别是LDL，在动脉壁内皮下的积累是AS的初始阶段。这种积累被巨噬细胞摄取，巨噬细胞分化为泡沫细胞并积累细胞内胆固醇，导致先天免疫和炎症介质的激活。细胞因子，如干扰素γ（IFN-γ）和IL-6，也可以通过结合相应的细胞因子受体触发炎症反应，促进斑块形成。
当前研究表明，趋化因子信号通路、胞质DNA感知通路、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路、NF-κB信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用都在AS的发生、进展和并发症中起重要作用，这与我们的分析一致。在发现DN和AS中富含免疫和炎症反应后，我们假设以细胞因子-细胞因子受体相互作用为主的免疫相关通路，加上ECM的改变，可能是AS和DN发展的共同途径。整合基因库产生了三个中心基因：ID4、RNF213和PRCP。ID4的表达降低，而后两个基因在DN和AS组中的表达显著高于对照组，外周血中PRCP的表达有望成为DN临床诊断的潜在标志物。
ID4位于6号染色体短臂2区2带3亚带（6p22.3），是ID家族中最长的蛋白质。作为分化调节因子，ID4在脂肪细胞分化中起关键作用，其减少可导致分化受损。此外，ID4与M0巨噬细胞呈正相关，M0巨噬细胞随疾病进展而积累，并可分化为M1、M2、TNF-α等多种形式，参与DN和AS的致病过程。RNF213是一种E3泛素蛋白连接酶。研究表明RNF213与炎症和胰岛素通路相关，具体参与TNFα介导的巨噬细胞炎症和脂肪细胞炎症介导的胰岛素抵抗。此外，RNF213通常与烟雾病的易感基因相关，其变异体如p.R4810K已知会导致动脉脆性和对血流动力学应激的易感性，改变AS从而增加ASCVD的风险。在内皮细胞中，由Th1和Th2产生的IFN-γ和TNF-α在体外和体内协同激活RNF213的转录。研究发现RNF213与静息CD4记忆T细胞呈正相关，在此机制未知的活化过程中，RNF213和CD4+ T细胞、Th1、Th2、IFN-γ和TNF-α等介质可以触发正反馈循环，增强肾脏损伤并诱导斑块形成，从而促进慢性炎症。
最后，发现PRCP在AS和DN样本中显著升高，并且在外周血中具有诊断潜力，同时也参与免疫和炎症反应。它是一种丝氨酸蛋白酶，主要位于溶酶体中，能够切割肽底物如血管紧张素II和α-MSH。据报道，AS、炎症和DN患者血浆PRCP水平显著升高，并且与疾病严重程度密切相关。最近，研究首次观察到PRCP在人体脂肪组织中的活性，并证实PRCP通过免疫调节参与血糖和脂质代谢。此外，炎症和纤维化的关键调节因子IL-1β和TGF-β1也被证明与PRCP相关，循环胰岛素样生长因子1（IGF1）的减少与内皮细胞中的炎症和TNF-α活化密切相关。AS和DN数据集分析表明PRCP与活化NK细胞、浆细胞和静息NK细胞等免疫细胞相关。因此，推测PRCP在NK细胞分化过程中参与DN和AS的发展。
结论
这项开创性研究利用生物信息学分析来检查DN和AS的共同通路和遗传诊断标志物。研究结果表明，细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路可能在DN和AS的发展中发挥作用，并有可能作为DN并发AS的诊断标志物。此外，研究的免疫浸润相关性分析表明，这些病症的发病机制可能与ID4、RNF213和PRCP表达失衡有关。这项研究为探索DN并发AS的潜在机制提供了新的视角。
