《OncoImmunology》：Killing cancer takes guts: lessons learned from the manipulation of gut microbiome and immunotherapy for the future of urothelial carcinoma
Abstract
尿路上皮癌（UC）是全球发病率和死亡率较高的常见癌症。免疫检查点抑制剂（ICIs）革新了UC的治疗格局，越来越多证据表明肠道微生物组通过调节免疫系统功能影响该疾病的免疫治疗效果。本文回顾了临床前基础，阐明肠道微生物组操控如何改变癌症患者免疫疗法疗效，重点介绍了当前用于优化肠道微生物组多样性的干预措施，总结了支持肠道微生物组在改善免疫治疗结果中作用的近期和进行中临床试验，并讨论了在真实世界中改善UC患者免疫治疗结果的临床意义。
Introduction
免疫疗法显著改变了包括尿路上皮癌在内的癌症治疗格局，现已成为几乎所有分期膀胱癌多线治疗的标准方案。在UC中研究最深入的两种免疫治疗策略是抑制程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的单克隆抗体，它们诱导并增强针对肿瘤相关抗原的T细胞介导的免疫反应。尽管部分患者获益显著，但大多数患者对免疫疗法无反应。除患者和肿瘤特异性因素外，肠道微生物组与抗肿瘤免疫的关系已成为日益重要的研究领域。
肠道微生物组是宿主系统内以共生方式存在的复杂微生物系统，包括细菌、原生动物和病毒，在消化、代谢和免疫功能中扮演重要角色。当前研究表明，肠道微生物组促进抗原呈递、T细胞活化和肿瘤浸润，并通过增强分子模拟直接产生细胞毒性。
Antibiotic treated mice demonstrate impaired immunotherapy efficacy
临床前研究通过研究缺乏天然微生物组的宿主的免疫反应，为肠道微生物组的免疫调节特性提供了基础性见解。在多项小鼠研究中，使用抗生素灭菌处理肠道微生物组的小鼠对免疫检查点抑制剂（ICIs）的反应显著受损。例如，Routy等人的一项著名研究中，给予小鼠氨苄青霉素、多粘菌素和链霉素组合以灭菌肠道，随后接种MCA-205肉瘤和RET黑色素瘤细胞。与对照组相比，这些小鼠在接受抗PD-1单药或联合抗CTLA-4治疗时，表现出明显降低的抗肿瘤反应和更差的生存率。Routy等人还显示，在非小细胞肺癌（NSCLC）、肾细胞癌（RCC）和尿路上皮癌患者中，PD-1阻断前接受抗生素治疗的患者反应显著更差。这些研究支持微生物组参与系统性免疫反应，并提出了完整且充分优化的肠道微生物组有助于最大化免疫疗法疗效的观点。
这些反应受损的潜在机制被认为涉及先天性和适应性免疫的发育和功能改变及损伤。肠道微生物组参与生理免疫调节的多个方面，包括促进T细胞的启动和活化、树突状细胞的成熟以及对于抗肿瘤免疫至关重要的细胞因子（如干扰素-γ和白细胞介素-12）的产生。破坏这些过程会导致免疫疗法给药后抗肿瘤免疫反应减弱。
Evaluating specific gut microbiotas and influences on immunotherapy
多个研究团队致力于识别与免疫疗法反应相关的特定细菌。Routy等人试图对微生物组模式进行分类，以随后研究直接细菌替换对免疫疗法疗效的影响。他们使用鸟枪法测序进行定量宏基因组学分析，探索了免疫疗法应答者和无应答者之间微生物组的组成。他们注意到，在非小细胞肺癌和肾细胞癌患者中，Akkermansia muciniphila与积极的临床结果存在特别有利的关联，并且A. muciniphila的富集与无进展生存期（PFS）的统计学显著差异相关。他们还强调了应答者中Enterococcus hirae和Ruminococcus spp.的较高发生率。
Gopalakrishnan等人前瞻性地收集了112名转移性黑色素瘤患者在开始抗PD-1治疗前的微生物组样本，并在不同时间点分析了各组随后的肿瘤活检、血液标志物和免疫细胞亚群。他们注意到应答者和无应答者之间肠道微生物组的多样性和组成存在显著差异，应答者体内的alpha多样性（样本内多样性）显著高于无应答者，且与PFS相关。具体而言，应答者体内Faecalibacterium spp.、Ruminococcaceae spp.和Clostridiales spp.的丰度较高，而无应答者体内Bacteroidales以及Escherichia coli和Anaereotruncus spp.的丰度增加。免疫分析显示，应答者肿瘤样本中的CD8+T细胞密度高于无应答者，并且CD8+T细胞浸润与Faecalibacterium、Ruminococcaceae和Clostridiales的丰度呈统计学显著正相关。
其他小鼠模型验证了上述发现，并强调了免疫疗法疗效与特定微生物分类群的相关性，以及这些细菌的拯救或移植可以恢复免疫疗法疗效。Sivan等人在黑色素瘤小鼠模型中进行实验，注意到来自不同设施的小鼠肠道微生物组差异与抗PD-1治疗后黑色素瘤生长的差异相对应：来自Taconic农场（TAC小鼠）的小鼠肿瘤生长比来自Jackson实验室（JAX小鼠）的小鼠更具侵袭性。JAX小鼠还表现出更高的肿瘤特异性T细胞反应和瘤内CD8+T细胞积聚。宏基因组分析确定了JAX小鼠中Bifidobacterium spp.的丰度与肿瘤微环境内抗原特异性T细胞积聚及改善的肿瘤反应之间存在统计学显著关联。给TAC小鼠口服Bifidobacterium后，结果显示肿瘤特异性T细胞反应增强，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）向肿瘤的浸润增加，以及树突状细胞的IFN-γ产生增加。
Investigating features of the gut microbiome in urothelial carcinoma (UC)
肠道微生物组与尿路上皮癌（UC）的关联早已成为积极研究的课题。Aso等人在1992年进行了一项试验，研究对58名患者经尿道膀胱肿瘤切除术后给予Lactobacillus补充剂预防浅表性膀胱癌复发的效果，结果显示治疗组的无复发生存期是对照组的1.8倍。Naito等人在2008年研究了Lactobacillus casei作为益生菌在肿瘤经尿道切除后接受膀胱内表柔比星治疗的患者中的应用。他们报告称，接受L. casei补充剂组的3年无复发生存率显著高于对照组（74.6% vs. 59.9%）。Miyake等人表明，用吉西他滨和顺铂治疗，然后口服含Lactobacillus和Bifidobacterium益生菌的小鼠模型，与对照组相比，肿瘤体积减少显著更多，CD8+T细胞活化增加。
Pederzoli等人试图在PURE-01临床试验（NCT02773622）中作为转化相关性研究，研究接受帕博利珠单抗治疗的肌层浸润性膀胱癌（MIBC）患者的微生物分类群模式。在可获得免疫治疗前粪便样本进行检测的42名研究患者中，23名患者出现病理反应并被视为良好应答者。在应答者和无应答者之间注意到微生物分类群的独特差异。Sutterella属在应答者中富集，而Ruminococcus bromii物种在无应答者中富集。临床前原位动物模型也支持这些发现，并报告了R. bromii对抗PD-1抗体活性的负面影响以及在该临床前模型中生存期降低。
Wang等人研究了与一种名为Blautia coccoides的细菌相关的膀胱癌免疫疗法。他们注意到Blautia spp.在免疫疗法良好应答者中高度富集。他们描述了口服这些细菌补充剂如何导致胡芦巴碱水平升高，胡芦巴碱通过抑制β-连环蛋白表达，增强了CD8+T细胞的抗肿瘤活性。
Modulation of gut microbiomes improves immunotherapy efficacy
虽然无菌小鼠在给予免疫疗法时表现出受损的肿瘤反应，但小鼠模型中肠道微生物组的恢复已被证明可以挽救免疫反应。粪便微生物移植（FMT）是指将粪便物质以及其中的肠道微生物群从供体转移到受体的过程。多个团队评估了FMT和免疫疗法反应。Routy等人对8只无菌小鼠进行了来自非小细胞肺癌患者的FMT；其中4只小鼠接受了来自对免疫疗法有反应的人类患者的FMT，而另外4只小鼠接受了来自对免疫疗法无反应的人类患者的FMT。所有8只小鼠随后接种MCA-205肿瘤细胞，然后接受抗PD1免疫治疗。与对照组相比，接受应答者FMT的小鼠肿瘤生长显著减少，生存期改善，CXCR3+CD4+T细胞数量增加，脾T细胞中PD-L1表达增加。
Routy团队后来在表现出免疫疗法耐药性的RET黑色素瘤无菌小鼠模型中口服补充A. muciniphila和E. hirae，并注意到口服这些细菌物种后抗肿瘤活性得以恢复。他们进一步分析了口服补充后的免疫学机制，注意到用A. muciniphila和E. hirae重新定植无菌小鼠后，肿瘤引流淋巴结和肿瘤细胞中出现了CXCR3+CCR9+中央记忆T细胞。类似地，A. muciniphila定植与IL-12产量增加和表达CCR9的肠道趋向性CD4+T细胞水平升高相关。该团队注意到E. hirae与诱导TH17细胞水平和提高小鼠模型中细胞毒性T细胞与调节性T细胞的比率相关。
Gopalakrishnan等人用黑色素瘤模型进行了与Routy团队类似的实验。他们将无菌小鼠分配接受来自对抗PD-1疗法有反应（R-FMTs）或无反应（NR-FMTs）的人类黑色素瘤患者的FMT。两组小鼠随后接种黑色素瘤细胞以植入肿瘤。两组随后都接受抗PD-1治疗，并对其肿瘤、外周血和脾脏进行纵向相关性研究以分析免疫反应和肿瘤生长。有趣的是，到第14天，R-FMT组的肿瘤大小显著小于NR-FMT组。与NR-FMT组相比，R-FMT组肿瘤中的CD8+T细胞也更多，肠道中的CD45+免疫细胞和CD8+T细胞也增加。R-FMT小鼠肿瘤的质谱流式分析也显示，与NR-FMT小鼠相比，各自肿瘤微环境中的PD-L1上调。
Fecal microbiota transplantation (FMT)
几项研究利用操控宿主肠道微生物组的方法来观察随后对免疫疗法的反应。这包括在使用免疫疗法前使用抗生素对无菌小鼠和人类受试者进行灭菌，以及利用粪便微生物移植（FMT）来操控肠道微生物组以观察免疫疗法疗效。FMT是指将粪便物质——从而包括肠道微生物群——从健康供体转移给受体的过程。虽然FMT通常用于治疗严重的艰难梭菌（C. difficile）感染，但其应用已在其他多种背景下进行研究，包括免疫疗法。
FMT涉及选择健康供体，排除近期使用抗生素、有胃肠道疾病或炎症性肠病史、自身免疫性疾病或恶性肿瘤的个体，以最小化不良事件和传播感染的风险。此外，对供体进行血液和粪便检测，以确保供体和样本健康且无病原体。收集用于FMT的粪便是一个多步骤的过程。准备过程包括与盐水混合和过滤。样本经过处理并确认为合格后，即可进行递送。递送方式可能包括口服胶囊和直接递送（例如，食管胃十二指肠镜检查、结肠镜检查、保留灌肠等）。通常在移植前后进行肠道准备以清除任何污染的粪便物质并确保移植物健康，并努力避免在移植期间使用抗生素。受体通常在移植前也进行肠道准备。
粪便库是用于筛选供体以及处理、储存和分发高质量粪便用于FMT的集中系统。虽然这个过程繁琐，但最近有一些技术进展可能加快这一过程。其中一种方法是使用冷冻粪便样本，其在艰难梭菌感染治疗的FMT中已被研究并显示出良好效果。类似地，几项研究使用口服胶囊作为FMT的递送方法，这通过减少手术室时间大大提高了护理的可及性。在制造FMT口服胶囊的过程中，单次30克的粪便捐赠可以产生多个剂量。
尽管FMT仍然是医学进步的一个有前途的途径，但其使用尚未标准化。如上简要概述的过程可能很繁琐，普适性仍然是一个问题。FMT的安全性和有效性依赖于严格的供体筛选方案，并且已经报道了关于多重耐药菌（MDROs）传播的担忧，美国食品药品监督管理局（FDA）也强调了这一点。FDA建议筛查产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的肠杆菌科、耐万古霉素金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐碳青霉烯类肠杆菌科。已经提出了彻底的筛查以标准化安全措施，包括血液和粪便检测、传染源调查、胃肠道合并症、一般健康参数和其他系统性健康状况。然而，FMT当然可以安全有效地进行，但使过程更具可扩展性和流线型的技术进步将有助于增加其在真实世界环境中的潜在用途。
FMT may help to overcome resistance to immunotherapy
已有几项治疗性临床研究探索了肠道微生物组在免疫肿瘤学中的影响。Baruch等人研究了来自2名对其黑色素瘤抗PD-1治疗有完全反应的供体的口服胶囊FMT，随后移植到10名抗PD-1难治性转移性黑色素瘤患者组中。这些作者报告称，其中3名患者此后出现反应，并注意到肿瘤细胞中CD8+细胞毒性T细胞浓度和IFN-γ基因表达增加。这项研究认为FMT可以促进其他免疫疗法难治性黑色素瘤患者的阳性反应，并为未来的进一步研究奠定了基础。
在一项类似的研究中，Davar等人评估了一组难治性黑色素瘤患者，并通过结肠镜检查进行应答者来源的FMT，以探索是否可以通过改变肠道微生物组来克服对抗PD-1疗法的耐药性。该组合耐受性良好，并在15名患者中的6名中提供了临床益处，肿瘤微环境中CD8+细胞毒性细胞和表达白细胞介素-8的髓系细胞类似增加。应答者具有独特的蛋白质组学和代谢组学特征，跨 kingdom网络分析证实这些特征受肠道微生物组改变调控。
Routy等人研究了两治疗组中的20名晚期黑色素瘤患者样本：10名对免疫疗法难治的患者和10名未经治疗的患者。他们通过口服胶囊进行了来自对免疫疗法有反应的健康供体的FMT。他们注意到，在10名对PD-1阻断难治的患者队列中，有6名患者对来自先前应答者的FMT产生反应；他们特别指出3名患者达到部分缓解，另外3名在12周时达到疾病稳定。在初治组中，他们报告称10名患者中有9名达到完全或部分缓解。他们还报告称，与无应答者相比，良好应答者随后在基线和FMT后循环和瘤内CD8+T细胞均增加。
Alternative methods to manipulate the gut microbiome
益生菌是施用的活微生物，旨在替换、改变或增强先天肠道菌群，是操控肠道微生物组的另一个有用工具。在一项小型单中心研究中，Dizman等人评估了30名未经治疗的晚期肾细胞癌（透明细胞或肉瘤样组织学）伴有中危或高危疾病的患者，这些患者以2:1的比例随机接受伊匹木单抗和纳武利尤单抗，联合或不联合CBM588（一种双歧杆菌活菌产品）。接受CBM588的患者的PFS显著更长（12个月 vs. 2.5个月，HR 0.15）。这项研究为涉及益生菌增强免疫疗法的多项试验铺平了道路。
此外，饮食干预可以影响微生物组环境。富含纤维和复合碳水化合物的饮食往往会增加微生物多样性并促进潜在有益细菌的生长。有趣的是，在小鼠模型中，高盐饮食被证明会对免疫疗法的反应产生负面影响，表明盐摄入在免疫反应中起作用。因此，饮食干预可以独立地用作一种方法来培养有益的肠道微生物组特征，从而更有利于癌症患者对免疫疗法产生积极反应。最后，如上所述，抗生素疗法可用于改变微生物组。对于可能需要免疫疗法的患者，抗生素管理是一个重要的概念，并且是一个积极研究的领域。
Scirgolea等人在《Nature Medicine》最近发表的一项研究描述了氯化钠（NaCl）在癌症免疫学中的作用。作者描述了CD8-T细胞在调节肿瘤分化中的关键作用，并描述了他们的实验室工作，显示NaCl补充剂如何抵消T细胞功能障碍并促进癌症消退。NaCl补充剂在机制上诱导IFN-γ产生和效应细胞分化；高盐饮食的小鼠能够通过抑制终末分化和增强CD8+T细胞的效力来减少实验性肿瘤的生长。作者描述了NaCl如何增强谷氨酰胺消耗，谷氨酰胺通常对转录重编程至关重要。
Gut microbiome and immune-related colitis
免疫检查点抑制剂（ICIs）革新了癌症治疗，但它们也与免疫相关不良事件（irAEs）相关。免疫相关性结肠炎常见且严重，当前研究表明基线肠道微生物组特征可能与结肠炎风险相关。研究已经在转移性黑色素瘤患者中调查了这种关系，强调了微生物组中Bacteroidetes的重要性。在Chaput等人领导的一项前瞻性研究中，分析了26名接受伊匹木单抗单药治疗的转移性黑色素瘤患者的微生物组组成，并与ICI相关性结肠炎的发生和发展进行了统计学比较。富含Faecalibacterium和其他Firmicutes的基线肠道微生物组与改善的临床获益相关，但也与高发生率的免疫相关性结肠炎相关。在一项类似的研究中，Dubin等人评估了35名接受免疫治疗的转移性黑色素瘤患者的肠道微生物组和结肠炎。他们还注意到Bacteroidetes浓度增加与抵抗发生IO相关性结肠炎相关。此外，肠道微生物组中涉及多胺转运和B维生素生物合成的某些遗传途径与结肠炎风险增加相关。然而，Andrews等人在其77名接受免疫治疗的转移性黑色素瘤患者队列中，注意到发生毒性的患者中Bacteroides的丰度显著更高。随着我们对微生物组的了解加深，理想情况下我们也能更好地理解潜在的毒性风险。绘制肠道微生物组图谱可以使临床医生更好地教育患者并为患者制定个性化治疗计划。
Current relevant clinical trials and investigations
随着连接肠道微生物组和免疫疗法反应的证据不断增加，已经进行或正在进行多项临床试验，研究操控肠道微生物组作为改善接受免疫疗法的癌症患者结局的方法。
Ongoing trials investigating FMT and immunotherapy in non-UC oncology
有几项正在进行的试验研究FMT联合ICI治疗癌症的作用。在泌尿生殖系统领域，MITRIC（NCT05286294）和TACITO（NCT04758507）试验正在研究FMT联合ICI治疗晚期癌症患者。MIRTIC（NCT05286294）试验计划招募20名在ICI治疗上出现进展的实体瘤恶性肿瘤患者，这些患者将接受来自对ICI有反应且反应持续时间超过12个月的患者的FMT。患者将接受最多5个周期的FMT并继续ICI治疗，随后分析安全性、客观肿瘤反应和其他结局。虽然该试验正在进行中，但已报告了9名患者的初步结果：6名黑色素瘤，1名RCC，1名胰腺癌，1名头颈部皮肤癌。所有患者都接受了至少一次FMT，9人中有8人接受了2次，目前有5名患者记录到疾病稳定作为最佳反应。FMT相关不良事件均为1级。尽管这些结果是初步的且研究仍在进行中，但目前的结果表明，FMT联合持续ICI治疗是可行且安全的。
TACITO（NCT04758507）试验正在研究FMT用于接受免疫治疗的转移性肾细胞癌（mRCC）患者。mRCC患者被随机分配接受阿西替尼加帕博利珠单抗联合来自对免疫治疗有完全且持久反应的患者的FMT或安慰剂。患者通过结肠镜检查接受FMT，随后在第90天和第180天通过口服胶囊接受FMT。终点包括PFS、总生存期（OS）和客观缓解率（ORR）。2024年欧洲肿瘤内科学会大会上公布的初步结果表明，接受FMT治疗的患者1年PFS率为66.7%，而对照组为35.0%（总患者数n=50）。该研究还注意到FMT组的ORR为54%，而安慰剂组为28%。这些初步结果也强调了FMT在提高mRCC患者免疫疗法活性和治疗反应中的作用。
类似评估FMT和免疫疗法联合应用的研究也正在前列腺癌（NCT04116775，一项正在进行的II期试验）和肺癌（NCT04924374, NCT04951583, 和 NCT05502913）中进行。有趣的是，NCT04924374不涉及肠道准备，而NCT04951583采用聚乙二醇给药进行肠道准备，NCT05502913正在探索通过结肠镜检查和口服胶囊施用FMT。
此外，在胃肠道癌症领域有多项试验正在探索FMT和免疫疗法，包括NCT04130763, NCT04729322, 和 NCT04975217。NCT04729322正在研究FMT对于接受抗PD-1的结直肠癌患者的疗效，使用基于抗生素的肠道准备（甲硝唑、万古霉素和新霉素）。NCT04975217正在研究通过结肠镜检查期间口服胶囊施用FMT，以评估可切除胰腺导管腺癌患者免疫相关不良事件的发生率。还有几项处于早期阶段的试验正在研究FMT在免疫肿瘤学中的作用，还有几项处于计划阶段。
PERFORM（NCT04163289）试验正在评估来自健康供体的FMT是否能够影响和/或预防免疫相关不良效应。已有初步结果报告在一组10名接受来自健康供体FMT的mRCC患者中，显示出相关的安全性特征和有希望的临床疗效数据。
Relevant ongoing trials for UC
多项研究正在进行中，探索针对接受ICI的UC患者的各种微生物组干预措施，以及探索微生物组特征作为ICI应答者可能的预测工具，这些研究将为UC患者提供丰富的信息。
NCT05220124是一项IV期研究，评估UC患者在接受富含Bifidobacterium、Lactobacillus和Enterococcus的益生菌胶囊外加免疫疗法后的生存率和反应率。UROBIOTA（NCT06675656）计划招募400名UC患者，以建立微生物组组成作为对膀胱内卡介苗（BCG）和两种不同化疗方案反应的预测工具。类似地，NCT04566029是一项在法国进行的前瞻性病例对照研究，旨在通过比较ICI良好应答者与无应答者的微生物组来识别预测ICI反应的微生物组特征。
NCT04601402是一项首次人体、开放标签、剂量递增和剂量扩展的I/Ib期研究，旨在评估一种活生物治疗产品（GEN-001，一种Lactoccocus lactis菌株的冻干制剂）和avelumab在患有局部晚期或转移性实体瘤（包括UC）且在接受至少两线包括抗PD-1疗法在内的批准疗法后出现进展的患者中的安全性、耐受性、生物学和临床活性。类似地，NCT06904573（IMPROVE）是一项多中心、随机对照的II期研究，评估免疫疗法联合益生菌在晚期UC患者中的疗效和安全性。
The potential role of the gut microbiome in immunotherapy for urothelial carcinoma: future directions
虽然肠道微生物组在免疫疗法中的作用已在许多癌症中得到探索，但其在调节尿路上皮癌免疫疗法疗效中的具体作用值得进一步研究。需要专门的研究来阐明这种关系。鉴于肠道微生物组对其他同样使用PD-1/PD-L1抑制剂的恶性肿瘤的免疫治疗反应已确立的影响，很可能有类似的影响适用于尿路上皮癌。有理由认为宿主肠道微生物组的组成和特征也会影响UC的免疫治疗结果。如果具有独特肠道微生物组特征的患者在接受免疫疗法治疗UC时，免疫疗法疗效也存在差异，那么这是一个值得探索的领域，因为研究结果可能显著影响临床结局。未来的研究应侧重于在免疫检查点抑制剂治疗之前、期间和之后描述所有尿路上皮癌患者的肠道微生物组特征，以此作为预测反应的一种方式。鉴于某些细菌物种与免疫疗法反应率之间存在明确关系，可以使用宏基因组学等先进测序技术来识别和量化患者粪便样本中存在的细菌物种。可以合理地认为这也可能是尿路上皮癌的一个特征，我们希望能阐明这种关联。此外，随着我们对应答者与无应答者特征的更多了解，未来的研究应侧重于操控肠道微生物组，从而操控肿瘤微环境，以帮助提高对ICI的反应率。无论是通过有针对性的饮食干预、给患者施用益生元或益生菌，还是FMT，找到使这些干预措施在临床中负担得起且可扩展的方法，对于可能显著改善UC患者结局至关重要。
Conclusion
进一步理解肠道微生物组与免疫疗法之间错综复杂的关系，特别是在尿路上皮癌中，对于改善患者结局和生存具有巨大潜力。UC是一种具有挑战性的疾病，但这一领域可以帮助临床医生治疗这些患者。了解患者独特的微生物群特征可以帮助临床医生选择和治疗计划，同时开发基于微生物组的干预措施可以为提高这些患者免疫检查点阻断疗效提供新的治疗策略。鉴于其在患者结局方面可能带来显著改善的潜力，这一新兴研究领域值得关注和投入专门的研究努力。
