植物物种、代谢物与环境因子共塑放牧草地叶际微生物群落

《Applied and Environmental Microbiology》：Plant species, metabolites, and environmental factors shape the phyllosphere microbiota of grazed grasslands

本文深入探讨了温带永久性草场中三种优势植物（黑麦草、绒毛草与白三叶草）叶际微生物群落的结构与驱动因素。研究揭示了植物物种（解释度32%）和采样季节（解释度26.7%）是塑造叶际菌群的主要力量，而氮肥施用影响相对微弱（2.7%）。研究创新性地发现，植物叶片内特定的可溶性碳水化合物（如水溶性碳水化合物WSC）——禾本科的果聚糖（fructans）和豆科的白雀木醇（pinitol）——水平与微生物群落组成显著相关。此外，短期天气参数（如昼夜温差TR、降雨量Rf）也是关键环境驱动因子。该研究为理解草地作为有益微生物（如用于乳制品生产的微生物）储备库的生态系统服务提供了新视角。

　　

ABSTRACT

叶际是地球上巨大的微生物多样性储库。本研究旨在识别驱动永久性草场叶际微生物群落结构的关键因素。研究选取了两种相邻草场（一种施氮肥F+，一种不施氮肥F-）中的三种植物：两种积累果聚糖的禾草（多年生黑麦草^{Lolium perenne}和绒毛草^{Holcus lanatus}）和一种不积累果聚糖的豆科植物（白三叶草^{Trifolium repens}）。在夏季和秋季的三个时期（P1早夏、P2晚夏、P3秋季）采集样本，并记录天气参数。研究对植物微生物群进行了细菌计数和宏条形码（metabarcoding）分析，并评估了叶片的碳（C）、氮（N）含量及气孔导度调节（通过δ¹³C指示）。

微生物定植与群落结构

微生物平板计数显示，植物物种是主要影响因素，白三叶草叶片上的细菌数量显著高于两种禾草。甲基杆菌（^{Methylobacterium}）在白三叶草中的数量也显著更高。扫描电镜图像揭示了叶片表面丰富的微生物形态多样性，包括杆状、球状，以及单细胞和聚集态形式。

16S rRNA基因测序分析表明，叶际细菌群落的组成因植物物种而异。主坐标分析（PCoA）显示，白三叶草的样本与两种禾草的样本明显分开。施肥水平（F+ vs F-）对微生物群落整体结构影响较小，而采样时期的影响显著，P1时期的群落结构与P2、P3时期不同。白三叶草的微生物群落以甲基杆菌为主导（占序列11.7%-27.8%），其次是鞘氨醇单胞菌（^Sphingomonas）和土杆菌（^Pedobacter）。两种禾草的微生物组成相似，以膜杆菌（^Hymenobacter）、甲基杆菌和土杆菌为主，但根瘤菌（^Rhizobium）在绒毛草中更丰富，而鞘氨醇单胞菌在黑麦草中更丰富。α多样性指数表明，绒毛草的细菌群落物种数最高，而黑麦草的群落均匀度较高，白三叶草则有明显的优势操作分类单元（OTUs）。

驱动叶际微生物群落的关键因素

置换多元方差分析（PERMANOVA）证实，植物物种和采样日期是叶际微生物群落结构的最强驱动因子，施肥的影响较弱但显著。所有二阶交互作用均显著，其中植物物种与采样日期的交互作用最强。

外部环境因素：天气条件

非度量多维标度（NMDS）分析表明，采样前3天（3d）的日温差（TR）、降雨量（Rf）、日平均辐射（R）和蒸散量（ETo）是叶际微生物群落结构的显著驱动因子。TR_3d和Rf_3d的影响最大，且在NMDS第一轴上方向相反。这些趋势在单独分析每种植物时也基本一致，考虑采样前15天（15d）的天气数据时，风速（W）也成为显著影响因素。

内部植物因素：叶片生化成分

叶片水溶性碳水化合物（WSC）总量在白三叶草中（约100 mg·g^-1DW）远低于两种禾草（200-350 mg·g^-1DW），这主要源于禾草中积累的果聚糖。白三叶草叶片含有高水平的白雀木醇（高达40 mg·g^-1DW）。NMDS分析显示，当三种植物一起考虑时，总WSC和蔗糖水平显著驱动微生物群落结构，将豆科与禾草区分开。单独分析白三叶草时，其叶际微生物群落结构与白雀木醇含量显著相关。叶片碳氮比（C:N ratio）和δ¹³C（作为气孔导度调节指标）也显著影响微生物群落结构。

DISCUSSION

本研究揭示了放牧草场叶际细菌群落组成主要受植物宿主物种和年份时期支配。叶片形态（如白三叶草的气孔密度、禾草的叶脉沟槽和绒毛）的差异可能影响微生物的定植。特定的可溶性碳水化合物，如豆科的白雀木醇和禾草的果聚糖，可能通过作为碳源或信号分子在塑造特定微生物群落方面发挥作用。天气因素，特别是短期的昼夜温差和降雨，对群落结构有重要影响。季节性的群落变化与先前研究一致。草场管理（如施氮肥）的影响相对较小。研究强调了草场叶际微生物组作为植物和乳制品有益微生物储备库的潜力，其在评估草场生态系统服务（如支持生物多样性和提供农业食品微生物资源）时应被充分考虑。

结论

草地叶际微生物组受植物内在因素（物种、代谢物）和外在因素（季节、天气、管理）共同塑造。理解这些驱动因子对于认识草场作为微生物多样性热点及其在农业和食品系统中的价值至关重要。