肿瘤内功能性异质CD4+CD8+双阳性T细胞可作为单阳性T细胞的前体

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Functionally heterogeneous intratumoral CD4+CD8+ double-positive T cells can give rise to single-positive T cells

本研究发现，肿瘤浸润性CD4+CD8+双阳性（DP）T细胞不仅具有细胞毒性功能，能通过MHC I/II类分子依赖方式杀伤自体肿瘤细胞，其T细胞受体（TCR）克隆特征还可预测PD-1阻断疗法的临床反应。更重要的是，研究首次证实肿瘤微环境（TME）可作为胸腺外场所，支持DP T细胞向单阳性（SP）T细胞的双向分化，为癌症免疫治疗提供了新靶点。

　　

Significance

传统上认为，CD4⁺CD8⁺双阳性（DP）T细胞是胸腺内的T细胞前体。尽管在癌症患者的肿瘤中发现了这类细胞，但其在肿瘤环境中的作用尚不完全清楚。通过单细胞分析，本研究展示了肿瘤内DP T细胞拥有广泛的基因程序，并对其进行了功能性验证。研究发现，DP T细胞中包含具有自体抗肿瘤活性的克隆扩增细胞毒性细胞，并且能够预测患者后续对PD-1阻断疗法的反应。研究不仅揭示DP T细胞是一种未被充分认识的、对免疫疗法有反应的抗肿瘤免疫效应细胞，还首次提出其可作为癌症患者胸腺外单阳性（SP）T细胞的来源。这些发现有望促成改进的癌症免疫治疗方法。

Abstract

传统的单阳性（SP）CD4⁺和CD8⁺T细胞能够识别肿瘤抗原，并有助于介导癌症免疫治疗的临床反应。CD4⁺CD8⁺双阳性（DP）T细胞在人类癌症中也有报道，但它们在肿瘤微环境中的作用仍不明确。通过生成DP和SP T细胞的多组学单细胞图谱，研究发现DP T细胞具有与SP T细胞相似的表型异质性，其中包括人类肾细胞癌（RCC）中多个克隆扩增的细胞毒性DP T细胞群体。这些肿瘤内DP T细胞能够介导依赖于MHC I类和II类的自体肿瘤细胞杀伤。此外，对携带DP TCR的T细胞进行转录谱分析发现，其基因特征在晚期RCC患者中对PD-1阻断疗法的临床应答者中富集。研究证实了先前关于SP T细胞向DP T细胞转化的观察，更重要的是，证明了肿瘤内T细胞具有双向分化能力，即DP T细胞在体内可作为SP T细胞的前体。在后一种情况下，肿瘤内DP T细胞被证明表达Rag2，这表明肿瘤可能作为T细胞发育的胸腺外场所。这些发现揭示了DP T细胞在抗肿瘤免疫中可能扮演的多重角色。

Results

Spatial Survey and Transcriptional Atlas Reveals Heterogeneity of DP T Cells in Kidney Cancer Patients.

除了常规的SP CD4⁺或CD8⁺T细胞外，通过免疫组织化学染色，在RCC患者的肾癌组织和癌旁正常肾组织中都发现了DP T细胞。流式细胞术和单细胞测序分析显示，RCC患者的所有匹配样本（外周血单个核细胞PBMCs、肿瘤组织和癌旁非恶性组织）中均存在CD4⁺CD8⁺DP T细胞。与健康供体的PBMCs相比，DP T细胞在肿瘤组织中的频率显著增加。肿瘤样本主要由常规的CD8⁺SP T细胞组成，与正常肾脏、患者PBMCs和健康供体PBMCs相比，效应性FOXP3^-CD4⁺SP T细胞相对减少。

对来自RCC患者和健康供体PBMCs的105,553个细胞进行单细胞RNA测序，构建了DP/SP T细胞图谱。CD4⁺、CD8⁺和DP T细胞形成了七个不同的状态簇，DP T细胞在所有状态中均有良好代表性，揭示了该独特T细胞亚群内的表型异质性。这些状态包括细胞毒性细胞（表达GZMB, GZMK, PRF1）、中央记忆细胞（表达CCR7）、初始细胞（表达CCR7但ANXA1低表达）、调节性T细胞（表达IL2RA, FOXP3）、黏膜相关恒定T（MAIT）细胞（表达SLC4A10）和增殖性T细胞（表达MKI67）。细胞毒性状态和增殖状态均高表达与终末耗竭CD8⁺T细胞相关的基因特征，并且GZMK和PROLIF细胞在肿瘤内的比例增加，支持了PD-1表达、终末耗竭与TME内接触同源抗原增加之间的关系。

Tumor-Infiltrating DP T Cells Possess Lytic Capacity Against Autologous Tumor Cells.

单细胞RNA测序图谱显示，与CD4⁺和CD8⁺SP T细胞类似，肿瘤内的DP T细胞中GZMK状态的频率显著更高。流式细胞术证实，肿瘤内DP T细胞高表达细胞毒性效应分子，其中颗粒酶K（Granzyme K）尤为富集。这些细胞表现出CD4和CD8表达的连续谱系，包括CD8^hiCD4^lo和CD4^hiCD8^lo亚群。重要的是，肿瘤内DP T细胞表达4-1BB和CD39的水平比正常肾脏或PBMCs中的对应细胞高出20倍，表明它们是高度抗原经验的T细胞。

功能实验表明，分离的肿瘤内DP TILs在与自体肿瘤细胞共培养时具有细胞毒性，能诱导肿瘤细胞死亡，其杀伤水平与CD8 TILs相当。通过使用抗MHC I类和II类抗体进行阻断实验，发现DP TILs的细胞毒活性部分依赖于MHC I类识别，但更显著地依赖于MHC II类介导的细胞毒性。联合使用抗MHC I类和II类抗体并未产生叠加效应。

DP T Cells Are Clonally Expanded.

通过单细胞TCR测序分析了DP与SP T细胞之间的克隆相关性。结果显示，DP T细胞经常携带与同一个体CD4⁺和CD8⁺SP T细胞重叠的TCR克隆型。在所有具有配对scRNA-seq和scTCR-seq数据的T细胞中，有48.7%的细胞表达了与DP T细胞相关的TCR。根据TCR共享模式，将T细胞分为三组：DP TCRs（携带DP TCR的T细胞）、CD4⁺Only TCRs和CD8⁺Only TCRs。

在携带DP TCRs的T细胞中，超过80%富集在细胞毒性状态（GZMB和GZMK）。与此类似，CD8⁺Only TCRs也主要存在于细胞毒性T细胞中，而CD4⁺Only TCRs则主要存在于初始和中央记忆T细胞中。克隆结构评估显示，DP TCRs比CD4⁺Only TCRs具有更大的克隆限制性。特别是在肿瘤内，DP TCRs在细胞毒性GZMK T细胞中的克隆限制性比其他克隆型亚组高出三倍以上。

Intratumoral DP TCR Gene Signature Predicts CPI Response.

为了评估肿瘤内DP克隆型对患者预后的影响，研究人员基于单细胞RNA测序数据，对携带不同克隆型亚组（DP、CD8⁺Only、CD4⁺Only TCRs）的肿瘤内T细胞进行了差异基因表达分析，生成了相应的转录程序。将这些基因特征应用于一项2期临床试验（IMmotion150）中晚期RCC患者治疗前的批量RNA测序数据，该试验包含atezolizumab（抗PD-L1）单药治疗、atezolizumab联合贝伐珠单抗以及舒尼替尼治疗组。

分析发现，DP TCR基因特征在抗PD-L1治疗组中显示出更长的无进展生存期（PFS），其风险比（Hazard Ratio）优于CD8⁺和CD4⁺only TCR基因特征。在联合治疗组中，DP TCR基因特征与改善的生存期显著相关。流式细胞术分析证实，肿瘤内DP T细胞高表达抑制性受体PD-1和TIM3，水平与CD8⁺T细胞相当，尤其是在GZMK表型中，这支持了这群未被充分认识的T细胞在检查点阻断反应中的潜在重要性。

DP T Cells Undergo Extrathymic Maturation in the TME.

为了探究肿瘤是否可作为体内T细胞发育的胸腺外场所，研究人员使用了同系MC38结直肠肿瘤小鼠模型。将该肿瘤细胞植入Rag2-GFP小鼠（其Rag2表达由GFP标记）体内。Rag2表达是TCR重组所必需的，标志着T细胞发育的早期阶段和近期胸腺迁出细胞。

正如预期，胸腺中的大多数DP T细胞为GFP⁺。令人惊讶的是，在肿瘤和脾脏中也观察到了GFP⁺的胸腺迁出DP T细胞。与GFP^-的DP T细胞相比，肿瘤、胸腺和脾脏中的GFP⁺DP T细胞具有更高的增殖能力，并表达显著更高水平的CCR7和CD62L，而CD69表达较低。这些差异在SP TILs中完全不存在，表明肿瘤浸润的胸腺迁出DPs相对于肿瘤浸润的SPs是不成熟的。在RCC患者组织中验证了这一结果，观察到罕见的RAG2在DP TILs中的表达。免疫染色还证实了RAG2阳性的DP TILs表达S1PR1，这是一个介导DP T细胞克隆驱逐的关键基因。

In Vivo DP-to-SP T Cell Transitioning in the TME.

尽管先前研究描述了SP T细胞在肿瘤小鼠体内重新表达CD4或CD8共受体，本研究则通过过继性T细胞转移（ACT）实验重点探究了DP T细胞是否能在体内向SP T细胞转化。将来自供体CD45.1⁺小鼠的排序纯化的SP CD4⁺、CD8⁺或DP T细胞静脉注射到携带MC38肿瘤的CD45.2⁺Rag1 KO小鼠体内。

转移四天后，发现转移的CD4⁺SP T细胞在肿瘤中主要保持为CD4⁺SP，仅有极少数转化为DP。而超过30%的过继转移的CD8⁺TILs转化为了DP T细胞。更重要的是，超过45%的过继转移的DP T细胞在肿瘤内转化为了CD8⁺SP T细胞。

为了确定DP到SP的转化是否发生在RCC患者中，研究人员利用TCR序列追踪了克隆谱系。他们分离了仅在肿瘤内DP或SP T细胞中表达的扩增TCRs，并追踪了它们在RCC患者不同组织区室中的谱系和表型轨迹。结果不仅检测到肿瘤内SP TCRs存在于癌旁正常组织和外周血中一小部分成熟的DP T细胞中，更重要的是，还发现了肿瘤内DP TCRs存在于肿瘤外的成熟SP T细胞中，并且明显偏向于CD8⁺SP身份——这表明肿瘤内DP T细胞可以分化为SP T细胞。

对已发表的单细胞数据（来自B16肿瘤小鼠模型中CD8⁺Pmel⁺T细胞向CD4⁺CD8⁺DP细胞的转化）进行伪时间轨迹分析，揭示了与功能群体一致的不同分支点。沿伪时间连续体的差异表达分析识别出转录因子Bcl11a、Spi1(PU.1) 和 Mef2c的上调——这些都是T细胞发育和命运决定中高度保守的核心调控基因。

Discussion

本研究揭示了DP T细胞在肾细胞癌中介导抗肿瘤反应的重要性。首先，识别了一个细胞毒性DP效应群体，其共表达细胞毒性和免疫检查点分子，可能是未来临床试验的潜在治疗候选。其次，这些细胞在肿瘤内显示克隆扩增，并能以MHC I类和II类依赖的方式诱导肿瘤细胞死亡。最后，观察到活化的胸腺样DP TILs分化为SP T细胞，这提示了在肿瘤内促进胸腺外谱系定型的潜在机制。这些发现指出了理解具有效应功能的多种T细胞亚群在RCC患者抗肿瘤免疫中的重要性，以便我们能在未来的癌症免疫治疗中有效利用这些机制。

Methods

详细材料与方法见补充信息。主要包括人体样本与小鼠模型的获取与处理、流式细胞术分析、细胞毒性分析、图像定量、单细胞RNA测序与TCR测序数据分析、基因特征推导与临床关联分析以及统计方法等。所有统计分析均在图注中说明。