《Environmental Science & Technology》：Novel Insights into the Distribution and Effects of Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) in the Nervous System of a Frog Tadpole Model by Mass Spectrometry Imaging
引言
质谱成像（MSI）是一项令人兴奋的技术，它为质谱分析增添了空间信息，允许在组织内绘制特定分子的分布图。这在脑和嗅觉感觉系统中尤为重要，因为大脑的不同区域具有截然不同的功能。本研究利用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）MSI方法和 cosmopolitan American bullfrog (Rana [Lithobates/Aquarana] catesbeiana) 蝌蚪，创建了一个高度相关的生物模型，用于研究环境污染物在组织中的分布。
传统的基于质谱的分析方法研究污染物的生物累积涉及组织匀浆以提取和定量目标化合物。这些技术功能强大，但在匀浆过程中失去了组织的异质性。此外，极小的组织或组织区域很难在不被周围组织污染的情况下进行提取，例如大脑的功能区域及其相关腺体。相比之下，MSI规避了这些限制，能够分析组织中分子的空间分布，包括污染物。
全氟和多氟烷基物质（PFAS）构成了一个庞大、多样化的合成化学品家族，广泛用于消费品中。它们在动物组织中的持久性、生物累积和生物放大效应引起了极大关注，并与动物和人类的众多有害健康效应相关。这些效应包括内分泌系统（尤其是甲状腺轴）干扰、免疫系统功能改变、行为和认知障碍，以及不良生殖和发育结局。最后一类包括与神经发育毒性的联系，例如神经递质水平、髓鞘形成和神经元间信号传递的破坏，这与自闭症谱系障碍有关。
一种传统的PFAS，全氟辛烷磺酸（PFOS），曾被广泛用于众多消费品中。例如，它被用作地毯、织物、室内装饰品和食品包装的防污剂，灭火泡沫中的表面活性剂，以及防火航空液压液和光刻化学混合物中的关键成分。尽管PFOS的使用现在在许多地方已被禁止或限制，但其生产在一些全球性行业中仍然存在。此外，PFOS前体物的降解也可能成为其来源。该化合物高度抗降解和生物转化，在动物组织中生物累积，并可以转移给后代。因此，PFOS在环境中持续以高浓度被检测到，尤其是在点源（如消防员训练场）释放后。例如，对法国一个主要消防训练场的废水和径流采样显示，平均和最大PFOS浓度分别为57和892 μg/L。在同一训练区的污水处理厂出口，检测到的平均PFOS浓度为25 μg/L。
两栖动物是研究发育毒理学的杰出模型，因为它们对周围环境的变化极其敏感。它们的卵缺乏保护性外壳或膜，其发育中的幼体完全水生。因此，两栖动物在整个发育过程中直接暴露于地表水污染物。蝌蚪变态，即蝌蚪转变为青蛙的过程，需要器官和组织的广泛重编程和重组。这个过程与其他脊椎动物（包括人类）的发育转变有直接相似之处。因此，在这个高度敏感的发育窗口期，可以进行种间外推。综上所述，两栖动物是研究环境污染物组织分布及其对机体发育影响的优秀哨兵。本研究利用真蛙类的代表， cosmopolitan 蝌蚪模型 American bullfrog (Rana [Lithobates/Aquarana] catesbeiana)，创建了一个与环境相关的模型，可用作生物指示剂。
MALDI-MSI先前已被用于确定经口灌胃或胃灌注实验暴露后PFOS在小鼠肝脏、肾脏和心脏组织中的分布。此外，以600 μm分辨率进行的液体萃取表面分析质谱（LESA-MS）也已应用于成年斑马鱼整体。另一种已知健康问题的相关化合物，全氟辛酸（PFOA），也通过MALDI-MSI在小鼠皮肤上成功检测到，以显示组织渗透性，并在斑马鱼中显示全生物体组织分布。据我们所知，MALDI-MSI尚未应用于在模拟关键发育窗口期现实暴露场景的环境相关动物模型中研究PFOS的分布和效应。因此，我们开发了一种适用于研究蝌蚪组织中污染物空间分布及相关生物学效应的MSI工作流程。它使我们能够分析整个蝌蚪头部（包括嗅觉系统、眼睛和大脑）的10 μm切片。然后我们通过一项PFOS暴露研究验证了该方法。使用了五种PFOS浓度，范围从欧洲饮用水中最大总PFAS限值（0.1 μg/L）到PFOS从点源释放的最坏情况（100 μg/L）。该方法扩展了用于对野生动物生物区室中污染物及其分布和效应进行无偏筛查的分析工具箱。本文报道的新生物学见解将有助于提出关于PFOS暴露引起的发育神经毒性的新假设，推动环境和毒理学研究。
材料与方法
PFOS暴露
动物饲养与护理：混合性别的变态前Rana [Lithobates/Aquarana] catesbeiana蝌蚪在当地（加拿大不列颠哥伦比亚省维多利亚附近）捕获。它们被饲养在维多利亚大学室外水生动物单元的100加仑有盖玻璃纤维水箱中，水箱中含有循环的去氯市政水，水温为15 ± 1 °C，pH 6.8，溶解氧为96–98%。蝌蚪每天饲喂螺旋藻。动物的护理和治疗符合加拿大动物护理委员会制定的指南，动物伦理协议AE-23–005–01由维多利亚大学动物护理委员会批准。
动物暴露：暴露在12 L聚丙烯桶中进行，桶内用气石曝气，并通过将其置于浅的温控水盘中维持在24°C。每个桶包含8 L处理水和三只变态前蝌蚪。每个处理有2个桶，即每个处理总共有六只动物。名义暴露浓度为：0, 0.1, 1, 10, 50, 和 100 μg/L PFOS。动物在适应和暴露期间不喂食。每天测量水盘温度，并用测试条每日测试水质参数（pH、氨、硝酸盐和亚硝酸盐）。
在暴露前，蝌蚪在各自桶的去氯水中适应24小时。然后所有蝌蚪注射低剂量甲状腺激素甲状腺素（T4）以启动其变态进程。它们在去氯冰上短暂 immobilize 并在数字实验室天平上称重，准备T4注射。然后，按1 μL/g bw（四舍五入到最接近的0.5 μL）的剂量，将5 μM T4（溶于400 μM 氢氧化钠（NaOH）溶剂中）通过尾部肌肉进行腹腔注射。当动物离开桶时，将处理溶液以10 mL储备液（0.08–80 mg/L PFOS，溶于超纯水中）或纯超纯水（用于对照）的形式加入桶中。为避免操作者偏差，实验通过颜色编码处理进行盲法。盲法在生理终点（即体重和形态特征）数据和通过LC-TIMS-MS进行的血清分析数据收集中保持不变。然而，对于MSI和脑匀浆分析，有必要知道处理信息。
样品收集：在实验结束时，动物通过浸泡在0.1% (w/v) 三卡因甲磺酸盐（TMS）和25 mM碳酸氢钠溶液中进行麻醉和安乐死，随后进行放血。记录体重和形态特征。然后从靠近身体的尾部切口收集血样，允许在室温下凝结至少15分钟，并在4°C下以10,000g离心10分钟。将血清转移到新的微量离心管中，并在?80°C下储存直至分析。
用于MSI分析的蝌蚪头部以保留大脑组织完整性为重点进行解剖。因此，从嘴到头顶的整个部分被包埋在M-1包埋基质中。然后样品通过漂浮在液氮蒸气中快速冷冻，并在?80°C下储存直至分析。
为验证PFOS暴露浓度，在处理液加入后立即（t0）和项目结束48小时后（t48）从所有桶中收集水样（1 mL）。水样在?80°C下储存直至分析。
蝌蚪组织的质谱成像
样品制备：我们选择了三个处理组进行MSI分析：对照组（0 μg/L）、10 μg/L和100 μg/L PFOS；每组n= 5只动物。使用设置为?12/–10 °C（腔室/样品头）的冷冻切片机和C-35切片刀将样品水平冷冻切片至10 μm厚度。使用胶带转移来维持这些高度异质且易碎样品的结构完整性。粘有切片的胶带被安装在ITO载玻片上，每张载玻片包含三个样品，分别来自对照组、10 μg/L和100 μg/L处理，共分析了五张载玻片（每组处理分析n= 5只动物，总共分析N= 15只动物）。此外，使用一只来自最高暴露组（100 μg/L）的动物来研究大脑中检测到的PFOS信号范围。在这种情况下，同一只动物在不同切片平面的三个切片被安装在同一张载玻片上。
在所有载玻片上点样1微升 Splash Lipidomix 标准混合物以监测仪器波动。此外，将来自大脑区域下方的胶带固定组织的一小块区域切成五个独立的长方形，并在其上点样1 μL PFOS标准品（0.1, 1, 10, 100, 和 1000 μg/L）。将标准品点样在组织上以考虑组织基质引起的离子抑制和增强效应非常重要。
然后将载玻片喷洒norharmane基质溶液，用于负离子模式下的非靶向分析。Norharmane溶解在氯仿:甲醇（2:1）中，浓度为7 mg/mL，使用自动化喷雾器以特定参数进行喷洒。
在将载玻片放入仪器之前，通过向胶带施加压缩空气来评估其粘附性。这就是为什么某些载玻片上含有PFOS标准品的小长方形区域缺失的原因。
通过向未暴露的蝌蚪切片喷洒含有0.5 mg/L PFOS的norharmane基质来研究不同组织类型对信号的抑制和增强效应。使用点在未暴露蝌蚪切片上的10点标准曲线（2–1000 μg/L）评估方法的线性和灵敏度。使用SCiLS Lab软件中的定量模块，通过空白和最低标准品（2 μg/L）的标准偏差（SD）估算检测限（LOD）。
数据采集：基质辅助激光解吸/电离（MALDI）-MSI分析在timsTOF fleX MALDI-2仪器上进行。质量范围设置为m/z500–1500，并使用了捕获离子淌度（TIMS）。选择宽质量范围是为了创建一个多功能方法，适用于一系列污染物，并且能够研究对生物分子的影响。为确保方法可转移到其他仪器，仅使用主激光（即不使用二次电离）。在所有实验中使用的像素大小为50 μm × 50 μm，除了报告中提到的子集样品，其中嗅觉上皮和松果体区域以20 μm空间分辨率成像。激光频率设置为10 kHz，每个像素累积999次射击。手动调整自定义激光焦点以补偿胶带带来的额外高度。
每次成像实验前，通过直接灌注Agilent ESI LC-MS调谐混合液在电喷雾（ESI）模式下进行校准。扫描范围内的离子用于校准。此外，利用在线校准来校正成像运行期间可能发生的任何质量偏移。使用以下离子进行在线校准。由此产生的质量准确度使用 [PI(38:4)-H]?离子进行评估，在整个数据集上为2.5 ppm。在所有载玻片上，分析了仅含基质（无组织、包埋介质或胶带）以及基质在包埋介质和胶带上（无组织）的小区域作为阴性对照。在所有载玻片上点样Splash Lipidomix标准混合物以监测运行间的波动。观察到一些轻微的波动，但在扫描范围内没有明显的灵敏度增加或减少趋势。最后，在每个载玻片的组织小方块上点样PFOS标准品（0.1–1000 μg/L）作为阳性对照。
采集后苏木精/伊红（H&E）染色：MSI数据采集后，对样品进行H&E染色以可视化组织的形态特征。需要对粘附胶带上的样品进行染色方案的修改。首先，在3次更换的冰甲醇中去除基质，并将样品在10%福尔马林中固定1小时。然后通过乙醇系列（每次2分钟）：100%、100%、90%、70%、50%进行再水化，随后在水中2分钟。载玻片在Gills No. 2苏木精中染色30秒，快速在水中冲洗2次，随后在1× Scott's改良自来水溶液中浸蘸3次，接着在酸化伊红Y中染色30秒。载玻片用乙醇系列洗涤和脱水（每次2分钟）。进一步的二甲苯脱水与胶带不兼容。最后，盖玻片直接安装在胶带上，载玻片用扫描仪以10,000 dpi分辨率扫描。
数据分析：数据在SCiLS Lab中处理和分析。PFOS离子图像在应用均方根（RMS）归一化后创建。为揭示PFOS对组织内源性脂质的影响，基于采集后H&E染色使用SCiLS中的画笔工具勾勒出三个感兴趣区域（大脑的髓鞘层、嗅觉上皮（OE）和松果体）。接下来，将这些区域的非归一化数据以imzml格式导出并导入R，其中应用Cardinal包。来自各个区域的质量谱根据组织类型进行分组。然后数据通过RMS归一化，并使用默认设置进行峰提取（信噪比阈值为3，质量容差为10 ppm，并过滤掉10%最低强度峰）。根据样品在载玻片上的位置定义处理组（对照、10 μg/L和100 μg/l），并拟合线性混合模型以识别处理间具有统计学显著差异（FDR < 0.1）的分子特征。对于此初步筛选，接受了较高的错误发现率。对于OE，这种方法给出了超过300个在对照组和PFOS暴露组之间存在显著差异的分子特征，因此改用FDR < 0.05。
通过检查峰形、强度和积分，手动筛选显示PFOS暴露后丰度发生显著变化的感兴趣的分子特征列表。所有不符合质量控制标准的分子特征被排除。此外，被识别为暴露组一部分的分子特征从效应分析中移除（这些是PFOS杂质）。过滤后剩余的化合物通过R包“lme4”的线性混合模型进行分析，并针对可能的批次效应（例如载玻片）进行调整。通过视觉评估QQ图和残差图进行模型检查，随后通过t检验（Tukey contrasts）进行事后配对比较。对于每次分析，使用预先指定的显著性水平p≤ 0.05。使用Pheatmap R包将显著受影响的分子特征的丰度可视化为热图，行上进行欧几里得聚类，列上不进行聚类。
分子特征注释：数据过滤后剩余的分子特征根据Viant等人指定的鉴定级别系统进行注释。最初，MSI数据在Metaboscape中通过搜索脂质物种进行分析，使用m/z、碰撞截面（CCS，使用TIMS测量）和mSigma（测量同位素模式与预测模式的偏差）值。将所得列表与通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）从蝌蚪脑匀浆获得的注释脂质组学数据集以及内部串联质谱库进行匹配。如果注释不一致，则基于直接从组织获得的质谱结果进行注释。
脑匀浆和血清的高分辨率质谱分析
样品制备：
脑匀浆：获得MSI切片后，从冷冻保存的组织块中提取剩余的大脑，并转移到2 mL Safe-Lock管中进行珠磨匀浆（每组浓度n= 6，总共N= 36）。未用于MSI的组（暴露浓度0.1、1和50 μg/L）的样品被切片至相同深度，以确保样品间无偏比较。提取遵循Post等人发表的操作流程。所有使用的溶剂均为LC/MS级。简言之，样品在含有抗氧化剂丁基羟基甲苯和5 μL内标脂质混合物（Splash Lipidomix）的800 μL冰甲基叔丁基醚:甲醇（10:3）中通过珠磨（2 s × 30 s, 25 Hz）进行匀浆。随后，加入200 μL冰0.1%甲酸以诱导相分离。进一步珠磨（3 s × 30 s, 25 Hz）后，样品在冰上静置10分钟，然后离心（15,000g, 15分钟）。将上清液转移至HPLC小瓶，在氮气下（37°C）蒸发，并重新溶解在流动相A中。
血清：血清样品（每组浓度n= 6，总共N= 36）按照Post等人为血浆指定的方法进行提取。简言之，将20 μL血清与1 mL冰MTBE:MeOH（10:3）混合，并加入5 μL Splash Lipidomix标准混合物。涡旋1分钟后（4°C, 1400 rpm），加入250 μL水，再涡旋45分钟（4°C, 1400 rpm）。样品在冰上静置平衡10分钟后，离心（4°C, 15,000g, 10分钟），将上清液移至HPLC小瓶，在氮气下（37°C）蒸发，并重新溶解在流动相A中。
数据采集和分析：样品在UHPLC-TIMS-MS平台上进行分析，该平台包括与Thermo Fisher Vanquish超高效液相色谱（UHPLC）系统联用的Bruker timsTOF flex MALDI-2。分析柱维持在55°C。进样体积设置为10 μL。流动相A为水:异丙醇:乙腈 2:1:1，含0.05%乙酸、20 μM磷酸和5 mM乙酸铵。流动相B为异丙醇:乙腈 1:1，含0.05%乙酸和5 mM乙酸铵。流速为0.6–1 mL/min，梯度如表S3所示。timsTOF flex在负离子模式下运行，设置如表S4所示。与MSI方法类似，质量范围设置为m/z500–1500。这里同样选择宽质量范围以创建一个适用于一系列污染物并能够研究对生物分子水平影响的多功能方法。在每个样品采集开始时，通过注射泵将Agilent ESI LC-MS调谐混合液直接注入ESI源进行在线重新校准。为此，将15分钟的LC-MS运行时间分为两个段，第一段（0.0至0.3分钟）用于注入调谐混合液，最后一段（0.3–15分钟）用于样品数据采集。使用传统的6通换向阀实现段之间的切换。
数据在MetaboScape中处理和分析。注释基于对脂质物种的搜索，使用m/z、CCS和mSigma值。将所得列表与从另一个蝌蚪数据集（UHPLC-TIMS-PASEF-MS数据采集于血清和脑）获得的脂质组学数据集进行匹配，该数据集使用MSDIAL和Bruker NIST中的谱图库在MetaboScape中进行注释。使用MS2分数>600的截止标准。脂质根据LIPID MAPS系统进行分类。
对于剂量-反应建模，从MetaboScape导出对数转换后的峰面积并导入R。通过半最小值法进行缺失值插补后，应用R包DRomics来揭示具有剂量-反应关系的特征。使用FDR < 0.1的二次趋势检验预选那些丰度随PFOS暴露增加而显著变化的特征，随后对这些特征拟合剂量-反应模型。用于选择最佳拟合的方法基于信息准则。计算基准剂量（BMD）为所谓的BMD-zSD，它考虑了拟合浓度-反应曲线的残差标准偏差。
通过LC-MS/MS进行暴露验证
向在动物加入桶之前和之后收集的250 μL水样中加入10 μL同位素标记的13C8–PFOS（cPFOS, 650 μg/L）。快速涡旋混合后，将样品转移至过滤管中并离心（10分钟, 14,000 rpm）。然后将250 μL样品转移至HPLC小瓶。定量在带有联用Agilent 1290 Infinity II超高效液相色谱（UHPLC）系统的Agilent 6495c三重四极杆系统上进行。目标分析物为PFOS和cPFOS（检测限0.01 ng/mL；定量限0.03 ng/mL）。在Milli-Q水中制备纯净标准品的十点校准曲线（0.01 – 100.0 μg/L）。所有小瓶含有固定量的内标（25 μg/L）。数据分析在Agilent MassHunter – Quantitative Analysis (QQQ) version 10.1中进行。
结果
MSI方法的优化
我们首先开发了一种MSI方法，使我们能够分析整个蝌蚪头部（包括嗅觉系统、眼睛和大脑）的10 μm切片。优化的样品制备方法使得尽管样品高度异质，仍能获得形态完整的冷冻切片。使用胶带将组织切片转移到载玻片上是实现这一改进的主要因素。磷脂是细胞的结构成分，也通过我们的数据采集方法被捕获。其中一些分子的空间分布，例如具有m/z885.55的磷脂酰肌醇PI (38:4)，与组织样品的形态特征相关。因此，我们使用这个分子来展示一般的组织结构和完整性。另一个尚未识别的分子特征（m/z528.27）也 consistently 提供了这个复杂区域的清晰结构定义。采集后的H&E染色允许进一步明确识别组织结构，包括各个大脑区域（例如端脑、间脑、被盖以及灰质和白质）、嗅觉上皮和眼睛的视网膜层。总之，该样品制备方法适用于研究污染物在组织中的分布及其对生物分子的潜在局部影响。
PFOS在蝌蚪神经系统中的分布
我们的第二个目标是在PFOS暴露研究的背景下验证所开发的方法。我们测试了五种浓度，范围从0 μg/L（对照组）到PFOS从点源释放的最坏情况（100 μg/L）。总共包括六个处理组，每组六只动物。其中，选择三个处理组进行MSI分析：0 μg/L（对照）、10 μg/L和100 μg/L PFOS，每组处理分析五只动物。由此产生的组织切片分布在五张显微镜载玻片上，使得每张载玻片包含每个处理组的一个组织切片（0 μg/L、10 μg/L和100 μg/L）。
首先，向未暴露的蝌蚪切片喷洒含有0.5 mg/L PFOS的norharmane基质，以研究不同组织类型对信号的抑制和增强效应。信号显示在脑的髓鞘丰富区域有轻微的信号抑制，并且在整个样品中变化
