无需扩增的快速RNA检测方法：通过将CRISPR-Cas13a与级联扩增DNA酶（RAPID）电路结合实现

《Analytica Chimica Acta》：Amplification-free one-pot RNA detection by pairing C RISPR– Cas13a with c ascade am plification c ircuit-driven DNAzyme (RAPID)

本研究开发了一款基于CRISPR-Cas13a和DNAzyme的快速、无需预扩增的RNA检测平台，可在37℃恒温下30分钟内实现高灵敏度（5 fM）和特异性的病原体检测，适用于POC诊断。

　　

尹晓娜|张子妍|罗浩|秦晓琳|陈阳|陈文涛|郑和平

中国南方医科大学皮肤病医院，广州510091

摘要：

RNA已成为诊断多种病原体的多功能靶标。在即时检测（POC）或资源有限的环境中，对快速准确诊断的需求正在增长。然而，大多数基于RNA的检测方法依赖于逆转录和复杂的仪器（例如RT-qPCR），这限制了它们在这些环境中的使用。等温扩增方法提供了一种更简单的替代方案，所需的仪器较少，但其高扩增效率引发了关于核酸交叉污染的担忧。为了解决这些挑战，我们开发了RAPID（CRISPR–Cas13a与级联扩增电路驱动的DNA酶），这是一种等温、一锅法RNA检测生物传感平台，无需样品预扩增。RAPID结合了CRISPR–Cas13a的精确目标识别和通过脚手架介导的链置换DNA电路实现的强大信号放大，从而消除了逆转录和热循环的需要。该平台能够在37°C下30分钟内实现定量RNA检测。通过重新编程RAPID crRNA，我们成功检测到了细菌（例如梅毒螺旋体（Treponema pallidum）和淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）以及病毒（例如单纯疱疹病毒）目标。RAPID平台设计用于多种检测，兼容荧光检测（RAPID-Flu）和侧向流动检测（RAPID-LFA）读数。RAPID-Flu和RAPID-LFA的灵敏度均为每反应5 fM，显示出可比的检测限。这两种方法都表现出优异的特异性，并与淋病奈瑟菌的临床诊断高度一致。总之，RAPID平台提供了快速、可编程且直观解释的解决方案，在POC诊断中具有巨大潜力。其灵活性和便携性使其特别适合早期诊断和现场监测多种传染性病原体。

引言

RNA在传染病监测和临床诊断中作为一种多功能检测靶标[1]，应用于多种病原体，如SARS-CoV-2[2]、登革热病毒[3]和结核分枝杆菌（16S rRNA）[4]。因此，迫切需要快速、简单且灵敏的RNA检测方法来支持及时的临床诊断和疫情控制。尽管逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）由于其高分析灵敏度[5]仍然是临床实践中RNA检测的金标准，但它涉及多个步骤，包括逆转录和PCR扩增[6]。笨重的热循环仪、耗时的工作流程和需要培训的人员限制了其在快速检测和即时检测中的应用[7]。

尽管已经开发了几种等温RNA检测方法，如滚环扩增（RCA）[8]、同时扩增和检测（SAT）[4]以及环介导的等温扩增（LAMP）[9]，这些方法在恒定温度下运行，但它们通常需要复杂的引物设计和多种酶。这些要求增加了系统的复杂性和成本，并增加了假阳性结果的可能性[10]。此外，扩增产物的积累会增加背景信号，从而降低检测灵敏度[11]、[12]。

最近，CRISPR/Cas（规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）系统在检测传染性病原体方面显示出巨大潜力，可提供单碱基分辨率[13]、[14]、[15]。它已被有效应用于检测寨卡病毒[16]、埃博拉病毒[17]、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）[18]和梅毒螺旋体（Treponema pallidum）[19]等病原体。诸如SHERLOCK等技术将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR–Cas13a结合，提供了高度敏感和特异的检测，包括单分子分辨率[20]。然而，这些多步骤操作增加了检测时间和污染风险。尽管已经开发了一锅法格式，但RPA混合物的高粘度可能会抑制Cas13a的活性，显著降低灵敏度[21]。因此，绕过预扩增的基于CRISPR的检测方法已成为诊断研究的主要焦点。

对于无需酶预扩增的检测方法来说，获得足够的信号并将信号可靠地转换为可量化的读数是一个主要挑战。脚手架介导的链置换（TMSD）是一种强大的无酶、等温信号放大策略，用于构建动态DNA电路和纳米结构[22]、[23]。值得注意的是，TMSD在室温下无需酶即可操作[22]、[23]。TMSD驱动的循环已在生物传感和核酸电路中得到广泛探索。例如，Wang等人报道了一种用于数字miRNA检测的目标循环扩增过程（TRAP），其中脚手架介导的链置换实现了高效的循环以提高灵敏度[24]。此外，RNA切割DNA酶是合成的单链DNA催化剂，在金属离子辅因子的存在下切割RNA，提供了另一种信号生成途径[25]、[26]。具体来说，10–23 DNA酶包含一个15个核苷酸的催化核心，两侧各有一个底物结合臂，在接近生理条件下切割RNA的嘌呤-嘧啶（rR–rY）连接处；与其他基序（如8–17，通常偏好AG连接）相比，10–23具有更广泛的目标选择性和良好的性能记录，便于合理设计臂[27]、[28]。它们的稳定性、可编程性和在等温条件下的活性[29]使DNA酶成为创新核酸检测平台中目标识别和信号生成的高价值组件[30]、[31]。这些方法通过将DNA酶读数与TMSD驱动的DNA电路结合来放大信号，解决了仅使用CRISPR检测的灵敏度限制。

在这项研究中，我们开发了RAPID，这是一种CRISPR–Cas13a耦合的级联扩增、电路驱动的DNA酶放大器，用于快速、无需预扩增的RNA检测平台。这种一锅法、等温平台结合了CRISPR–Cas13a的精确目标识别和DNA酶电路的信号放大，实现了快速周转和简化操作，无需电化学传感器或微流控设备。集成设计允许在封闭管中操作，并支持荧光（RAPID-Flu）和视觉侧向流动检测（RAPID-LFA）读数，适用于即时检测（POC）。我们通过实施针对病毒（单纯疱疹病毒1型，HSV-1）和细菌（梅毒螺旋体和淋病奈瑟菌）RNA目标的crRNA集，证明了RAPID工作流程的可行性。为淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）提供了全面的分析和临床验证，而HSV-1和梅毒螺旋体（T. pallidum）作为同一检测化学中的概念验证目标进行了评估。针对淋病奈瑟菌16S rRNA[4]，RAPID在合成样本中实现了高灵敏度和特异性，并在临床泌尿生殖道拭子样本中表现出稳健的性能。

材料与设备

HiScribe? T7快速高产量RNA合成试剂盒、Q5?高保真2× Master Mix和RNase抑制剂购自New England Biotechnology。LwaCas13a核酸酶购自GenScript Biotechnology。Tris-HCl（1 M，pH 7.5）、MgCl₂（1 M）和RNAlater稳定溶液购自Thermo Fisher Scientific Co。RNeasy Mini Kit购自QiAGEN。NaCl（2 M）、GelRed（10000×）、TBE缓冲液预混粉（1×）、6×甘油凝胶加载缓冲液和DEPC处理的水

RAPID平台原理

RAPID检测平台的原理如图1所示。由于Cas13a具有优先切割尿嘧啶核苷酸（rU）[13]、[37]的旁路切割活性，我们设计了一个含有五个rU残基的DNA发夹结构，使激活的Cas13a可以选择性地切割发夹中的rU区域。发夹的3’端携带一个23个核苷酸的触发序列，启动下游的TMSD驱动的DNA级联扩增电路，而部分互补性

结论

在这项研究中，我们开发了RAPID，这是一种一锅法、无需预扩增的等温RNA检测生物传感平台。通过将CRISPR–Cas13a的精确目标识别与TMSD驱动的DNA酶放大器的级联扩增相结合，RAPID实现了高分析特异性和灵敏度，并在临床样本检测中与参考临床检测方法完全一致。尽管已有概念相关的Cas13a–DNA电路/DNA酶检测方法被报道，但这些方法

CRediT作者贡献声明

陈阳：软件编写。陈文涛：写作——审稿与编辑、监督、资金获取。郑和平：写作——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。尹晓娜：写作——初稿撰写、方法学设计、数据管理、概念构思。张子妍：写作——初稿撰写、实验设计。罗浩：数据可视化、方法学设计、数据分析。秦晓琳：资源准备

利益冲突声明

作者声明以下潜在的利益冲突：郑和平和尹晓娜是与中国专利（专利号ZL 2024 1 1081343.5）相关的发明人，该专利涵盖了RAPID平台的某些方面。其余作者没有需要声明的利益冲突。

数据可用性

数据将根据请求提供。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：郑和平拥有专利号ZL 2024 1 1081343.5；尹晓娜也拥有该专利。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：82302579）和广州市科技计划项目（编号：202201000007）的支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿准备。我们衷心感谢南方医科大学皮肤病医院的临床实验室慷慨提供用于本研究的临床样本。