《Analytica Chimica Acta》：Nanobody-HRP fusion-based competitive immunoassay for rapid and sensitive serological detection of porcine deltacoronavirus
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本研究开发了一种基于纳米抗体-辣根过氧化物酶融合蛋白的竞争ELISA方法，用于快速灵敏检测猪德尔塔冠状病毒抗体。通过噬菌体展示技术从骆驼中筛选出高亲和力纳米抗体94Nb，构建稳定分泌该融合蛋白的HEK293T细胞系，实现检测无需纯化，灵敏度达1:640，特异性强，重复性好，检测时间缩短至60分钟，为PDCoV血清学监测提供了高效低成本工具。
侯成尧|赵丽军|康润民|储勤远|刘良凯|雷长伟|王宏宁|杨欣
教育部生物资源与生态环境重点实验室，四川省动物疾病防控与绿色发展重点实验室，四川大学生命科学学院，中国成都
摘要
背景
纳米体（Nbs）是一种源自骆驼科重链抗体的单域抗体，具有高稳定性、强亲和力和低成本生产的特点，使其成为生物分析应用中理想的识别元件。传统的检测猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）抗体的免疫测定方法通常需要纯化的抗体、多种试剂和复杂的实验流程，这限制了其在快速血清学监测中的使用。为了解决这些问题，需要一种高效、简单且灵敏的检测方法，将纳米体的识别能力与酶信号生成直接结合。
结果
我们开发了一种基于纳米体-辣根过氧化物酶（Nb-HRP）融合技术的竞争性ELISA方法，用于快速、灵敏地检测PDCoV抗体。通过免疫羊驼获得的噬菌体展示文库筛选出五种高亲和力的纳米体，其中Nb94表现出最高的结合活性。我们改造了一种稳定的HEK293T细胞系使其能够持续分泌Nb94-HRP，从而无需纯化即可直接用于检测。该ELISA方法的检测限达到1:640（基于建立的PI临界值），对相关猪冠状病毒具有高特异性，并且重复性良好（CV<10%）。优化后的检测流程可在60分钟内完成。这种方法消除了复杂纯化步骤的需求，为基于纳米体的抗体检测提供了一个模块化平台。
意义
这种基于纳米体-酶融合技术的检测方法成本低廉、检测速度快且灵敏度高，适用于PDCoV的血清学监测，展示了纳米体-HRP融合体作为多功能生物界面的潜力。其简单性、重复性和低试剂需求使其适用于高通量检测或现场应用，为动物健康诊断和广泛的生物分析提供了有前景的策略。
引言
猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是一种有包膜的单链正链RNA病毒，属于冠状病毒科（Coronaviridae）和尼多病毒目（Nidovirales）[1] [2]。PDCoV感染主要引起急性水样腹泻、呕吐和脱水症状，尤其是在免疫系统不成熟的新生猪仔中死亡率较高[3] [4]。该病毒于2012年首次在中国香港被发现，后续监测显示其已在全球多个国家和地区传播，对养猪业构成持续威胁[2] [4] [5]。
PDCoV的宿主范围广泛，实验研究表明它能感染多种哺乳动物和鸟类，包括小鼠、鸡和小牛[6] [7] [8]。特别值得注意的是，在三名海地儿童急性发热患者的血浆样本中检测到了PDCoV病毒，并成功分离出了具有传染性的病毒。基因组学和进化分析表明这些人类感染至少来自两次独立的动物源传播事件[9]。这一发现挑战了此前认为人类冠状病毒仅限于阿尔法冠状病毒（Alphacoronavirus）和贝塔冠状病毒（Betacoronavirus）属的观点，凸显了PDCoV的跨物种适应性和进化潜力。
PDCoV的基因组大小约为25.4 kb，是已知冠状病毒中最小的之一，具有典型的冠状病毒基因组结构：5′非翻译区（5′ UTR）-开放阅读框1a/1b（ORF1a/1b）-刺突蛋白（S）-包膜蛋白（E）-膜蛋白（M）-核衣壳蛋白（N）-NS7-3′非翻译区（3′ UTR）[1] [2]。N蛋白由342个氨基酸组成，是病毒复制过程中最丰富的结构蛋白之一[1] [2] [9] [10]。它主要位于细胞质和细胞核中，在RNA包装、病毒颗粒组装、复制调控和免疫逃逸中发挥关键作用[11] [12] [13] [14]。由于其高度序列保守性和强免疫原性，N蛋白能在感染早期引发强烈的抗体反应，使其成为血清学诊断的理想靶标[15] [16]。与基于S蛋白的检测方法相比，基于N蛋白的血清学检测方法由于N蛋白在不同PDCoV分离株间的序列保守性更高，通常具有更好的菌株覆盖能力。从分析角度来看，这一特性提高了检测的稳健性并降低了对抗原变异的敏感性。虽然基于S蛋白的检测方法在某些情况下可能具有更高的特异性，但它们对菌株依赖性的序列变异更敏感，可能更倾向于反映感染后期的中和抗体反应。相比之下，N蛋白早期的血清转化和强免疫原性使其更适合进行敏感和一致的抗体检测，尤其是在大规模血清监测和流行病学研究中。
纳米体（Nbs），也称为单域抗体（VHHs），来源于骆驼科动物的独特重链抗体。其分子量约为15 kDa，仅为传统IgG抗体的十分之一，是自然界中最小的抗原结合片段[17] [18]。它们紧凑的单域结构赋予了出色的稳定性、高亲和力、强的组织穿透能力和易于重组表达的特点。特别是其延长的互补决定区3（CDR3）使纳米体能够识别传统抗体无法识别的隐蔽或构象表位，从而在复杂抗原识别中具有独特优势[19] [20]。
纳米体已成功应用于针对多种病毒病原体的诊断检测，包括甲型流感病毒、非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）[21] [22] [23] [24] [25]。然而，目前尚无针对PDCoV的特异性纳米体研究，这一领域存在重要空白。鉴于其固有的优势，开发针对PDCoV的特异性纳米体有望建立高灵敏度和特异性的血清学检测方法。
目前，PDCoV的血清学检测仍较为有限，市场上也没有商用抗体检测试剂盒。在各种免疫测定方法中，酶联免疫吸附测定（ELISA）是最广泛使用的PDCoV诊断技术。其中，竞争性ELISA（cELISA）因其简单性、特异性和适合大规模筛查而具有明显优势[26] [27]。
基于这些考虑，本研究旨在分离针对PDCoV N蛋白的特异性纳米体，并开发基于纳米体的cELISA平台用于PDCoV感染的血清学检测。我们从一只免疫过的双峰骆驼中构建了噬菌体展示纳米体文库，成功筛选出五种高亲和力的纳米体。其中，纳米体94Nb与辣根过氧化物酶（HRP）融合形成了重组蛋白Nb94-HRP，用于建立一种快速、低成本且高度灵敏的cELISA方法。这项工作为PDCoV抗体检测提供了一种新的可行方法，并为其他新兴冠状病毒的纳米体基诊断检测提供了宝贵经验。
试剂和材料
T4 DNA连接酶、NotI-HF和PstI-HF购自New England Biolabs (Beijing) Ltd. (NEB)。Tritol试剂购自Thermo Fisher Scientific Inc。骆驼淋巴细胞分离试剂盒购自天津浩阳生物制品科技有限公司。All-In-One 5×RT Master Mix由Applied Biological Materials Inc. (abm)提供。In-Fusion Snap Assembly Master Mix和PrimeSTAR? Max DNA聚合酶购自Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd.
细胞系、质粒、血清和动物
人类
VHH文库构建和纳米体筛选
VHH文库构建和纳米体筛选的工作流程如图1a所示。重组抗原蛋白PDCoV N-GST（约64 kDa，图1b）和PDCoV N-His（约43 kDa，图1c）被成功表达和纯化。经过五轮PDCoV N-GST免疫后，单峰骆驼血清中的抗体滴度达到1:64,000，表明免疫反应强烈（图1d）。
第一轮PCR成功扩增了编码重链抗体的基因
讨论
PDCoV是一种新兴的肠道致病性冠状病毒，自首次发现以来一直在多个国家和地区的猪群中持续传播，对全球养猪业构成持续威胁，并因其跨物种传播潜力而引发日益严重的公共卫生问题[6] [10] [28] [29]。尽管在其他物种中偶尔检测到猪源病毒RNA，但目前尚无商业化的PDCoV疫苗。
CRediT作者贡献声明
康润民：验证、研究、数据管理。储勤远：软件开发、研究、数据分析。刘良凯：验证、研究。雷长伟：研究。王宏宁：写作、审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理。杨欣：写作、审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金筹集、概念构思。侯成尧：写作、初稿撰写、数据可视化、研究、数据分析、数据管理。
伦理批准和参与同意
所有动物实验均获得了四川大学生命科学学院动物伦理委员会（AEC）的批准（许可证编号：SYXK (Chuan) 2013–185）。所有涉及动物的程序均严格遵循四川大学制定的动物护理和使用规范。
致谢
我们的研究得到了四川省自然科学基金（2025ZNSFSC0212）、四川省重大科技专项（2021ZDZX0010）和四川省创新团队建设项目（Sccxtd-2026-08）的资助。
