《Frontiers in Microbiology》：Odoribacter splanchnicus inhibits toxin production in Clostridioides difficile: insights from clinical correlation and in vitro validation
1 引言
艰难梭菌（Clostridioides difficile）是一种革兰氏阳性、产孢子的专性厌氧菌，常定植于人类肠道，在肠道菌群失调（dysbiosis）时可引发艰难梭菌感染（CDI）。CDI的发病机制和临床严重程度主要由两种大型梭菌毒素——毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB）的产生产生驱动。这些毒素是导致CDI特征性症状（包括轻度腹泻、伪膜性肠炎和中毒性巨结肠）的主要毒力因子。在过去的几十年中，CDI已成为医院内胃肠道感染的主要原因，全球发病率不断上升，导致高发病率和死亡率，尤其是在住院患者中。
CDI的管理仍然是一个重大的临床挑战，主要源于病原体的多重耐药性。当前的一线治疗仍依赖于万古霉素、甲硝唑和非达霉素等抗生素。然而，经过三十多年的使用，对这些药物敏感性的下降导致治愈率降低和多重耐药菌株的出现。此外，万古霉素和甲硝唑等抗生素会进一步破坏肠道生态平衡，导致初始治疗后高达25-60%的高复发率。鉴于这些局限性，非抗生素方法——特别是那些针对微生物组的方法——重新引起了广泛的研究兴趣。粪便微生物群移植（FMT）通过恢复微生物多样性和定植抗性，已成为治疗复发性难治性CDI的有效干预措施。然而，FMT存在潜在风险，包括抗生素耐药基因的转移、病原体的无意传播、细菌易位和长期代谢并发症。一个有前景的方向是开发具有已知功能的明确微生物联盟或特定菌株，作为粗制粪便悬浮液的替代品，从而实现更有针对性、可重复的肠道菌群恢复。因此，识别与CDI进展直接相关的关键共生菌种，并理解其功能机制，对于指导开发靶向性微生物组疗法至关重要。
多项研究表明，CDI患者体内微生物群的群落组成和丰度与健康个体不同，包括丰富度和多样性降低，Faecalibacterium、Roseburia、Bifidobacterium、Blautia、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae等肠道共生成员的相对丰度下降。然而，旨在识别与患者CDI临床进展直接相关菌种的靶向研究仍然匮乏。因此，超越一般生态学观察，精确定位具有临床相关性的菌种并阐明其精确功能，对临床应用具有重要意义。
本研究利用16S rRNA测序技术，表征了住院CDI患者与非CDI患者的肠道菌群变化。研究特别关注无症状定植组和CDI组，旨在识别其丰度与疾病严重程度相关的细菌物种。分析结果显示，Odoribacter splanchnicus的丰度与CDI严重程度呈显著负相关。该菌为严格厌氧、革兰氏阴性、不产孢子的细菌，以其产生短链脂肪酸（SCFAs）的特性而闻名，这些特性使其成为开发下一代益生菌的有力候选者。本研究通过体外实验证明，O. splanchnicus能直接抑制关键毒力因子TcdA和TcdB的产生，并对艰难梭菌的生命周期（包括其生长和孢子形成）产生多方面的影响。研究结果有助于阐明共生菌在抵抗艰难梭菌致病过程中的保护作用，并为开发基于O. splanchnicus的CDI生物疗法铺平道路。
2 材料与方法
2.1 研究设计与标本收集
研究纳入了浙江大学医学院附属第一医院的117名住院患者，均获得知情同意。考虑到患者因不同原因住院并随后接受不同治疗，本研究除最低年龄18岁外未设置其他排除标准。收集的粪便样本根据腹泻和艰难梭菌定植状态分为四组：对照组（CN, n=30）、非CDI腹泻组（NCD, n=30）、CDI组（CDI, n=30）和无症状定植组（AC, n=27）。腹泻定义为24小时内≥3次稀便。过去3个月内有过CDI发作或CDI治疗的患者被排除在外。粪便样本收集于无菌容器中，立即送至实验室进行CDI诊断，然后于-80°C冷冻直至DNA提取。
2.2 粪便DNA提取与产毒艰难梭菌定量PCR
使用DNeasy PowerSoil Pro Kit提取粪便DNA。使用NanoDrop 2000测量DNA浓度和纯度。使用特异性引物通过定量PCR（qPCR）对产毒艰难梭菌进行定量。qPCR反应在C1000-Touch Real-time PCR仪上进行，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix。所有样本重复检测，当两个重复均为阳性时判定样本为阳性。
2.3 细菌16S rRNA测序与原始数据处理
使用引物343F和798R扩增细菌16S rRNA基因的高变V3V4区。扩增子经2%琼脂糖凝胶电泳检测，并使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化。纯化后的DNA样本送交上海欧易生物技术在Illumina NovaSeq6000平台上进行测序。原始测序数据已存入国家生物信息中心中国核酸数据库，登录号为PRJCA050088。
使用DADA2对原始测序数据进行修剪和过滤以获得高质量数据，并生成扩增子序列变异（ASV）及ASV丰度表。所有ASV均通过SILVA 138数据库进行注释和分类。
2.4 生物信息学分析
基于ASV水平识别每组的核心微生物群。使用Chao1指数估计CN、NCD、CDI和AC组的肠道细菌群落丰富度。基于未加权UniFrac距离进行主坐标分析（PCoA）以评估不同组间的细菌群落结构。使用分子生态网络分析（MENA）进行共现网络分析，并使用Gephi 0.10.1进行可视化。使用线性判别分析（LDA）及其效应量分析（LEfSe）来展示AC组和CDI组在属水平上的物种差异。应用Spearman相关分析分析差异菌属与疾病严重程度的相关性。CDI严重程度评分指数根据既往研究计算，纳入9个参数。
2.5 菌株与共培养系统构建
共培养使用的艰难梭菌（CD）菌株为实验室保存的临床分离株（序列型54，tcdA+/tcdB+）。O. splanchnicus标准菌株ATCC 29572（OS）购自中国河南的BeNa Culture Collection。CD和OS在37°C、厌氧环境下，于脑心浸液肉汤（BHIS）中培养。
为构建共培养系统，将CD和OS的单菌落分别接种于BHIS中，厌氧培养过夜。将每种菌株转接至新鲜培养基中，培养至对数生长中期（OD600nm= 0.3至0.7）。然后，以不同接种比例（CD:OS = 9:1, 1:1, 1:9）制备两种菌株的共培养物，最终接种浓度为1×107CFU/mL。
2.6 通过物种特异性qPCR确定共培养比例
在每个时间点（6h, 12h, 18h, 24h, 30h）取1 mL共培养物样本，离心后弃去上清液，细胞沉淀于-80°C冷冻直至提取基因组DNA（gDNA）。使用DNeasy PowerSoil Pro Kit提取gDNA。基于16S rRNA基因高变区序列设计OS特异性引物。CD特异性引物及qPCR反应如前所述。采用标准曲线法对CD和OS的拷贝数进行绝对定量。
2.7 通过ELISA检测共培养物中毒素产生
在接种后12、24、48和72小时收集培养上清液，监测毒素产生。使用ELISA试剂盒测定共培养物中的毒素（TcdA和TcdB）浓度。以培养用的空白培养基作为阴性对照，CD单培养上清液作为阳性对照。
2.8 tcdA和tcdB表达的相对定量
在12、24、48和72小时收取1 mL共培养物。离心收集细菌细胞沉淀。使用RNeasy mini kit从沉淀中提取总RNA，并进行柱上DNase I消化以消除基因组DNA污染。使用PrimeScript? RT Master Mix将分离的总RNA进行反转录。使用7500实时PCR系统进行定量PCR反应。使用SYBR? Premix Ex Taq Kit建立RT-qPCR体系和条件。使用2?ΔΔCT法计算相对基因转录水平。所有反应重复三次。
2.9 细胞毒性试验
在Vero细胞上进行细胞毒性试验。将Vero细胞传代至96孔板，使用前孵育24小时。在不同时间点收集的上清液离心并过滤后，取50 μL加入孔板中，于37°C、5% CO2条件下孵育18小时。使用空白BHIS培养基作为阴性对照。在光学显微镜下观察细胞圆缩情况。
2.10 乙醇耐受孢子形成试验
基于既往描述的程序，使用乙醇耐受性测定单培养和共培养系统中的孢子形成效率。将0.5 mL培养物与0.5 mL 95%乙醇混合，涡旋振荡，室温孵育15分钟，在1×PBS中系列稀释，然后涂布在含0.1%牛磺胆酸的BHIS平板上以计数孢子。
2.11 统计分析
单培养和共培养生长实验包含3个生物学重复，数据表示为平均值±标准误（SEM）。使用SPSS（24.0）进行单因素方差分析（one-way ANOVA）比较多组间差异，统计学显著性设定为p < 0.05。使用Origin 2024软件进行结果可视化。
3 结果
3.1 参与者特征
研究纳入的117名患者分为对照组（CN, 30例）、非CDI腹泻组（NCD, 30例）、CDI组（CDI, 30例）和无症状携带者组（AC, 27例）。各组患者的中位年龄约为60岁，AC组和CDI组中的大多数为长期住院患者（超过30天）。各组间的抗生素使用率无显著差异（p = 0.348）。
3.2 细菌群落结构分析
从117份粪便样本中共获得2,879个ASV。将存在于所有组中的ASV定义为核心类群，仅存在于一个组中的ASV定义为独有类群，由两个或三个组共享的ASV定义为其他类群。CN组和AC组的总ASV数量相近，而NCD组和CDI组的总ASV数量非常接近。所有组共享的ASV数量为264个，四组均有较大比例的独有ASV，其中AC组的独有ASV数量最高，其次是CN组、CDI组和NCD组。CN组和AC组共享的ASV数量最多。α-多样性分析表明，与CN组相比，CDI组和AC组的微生物多样性显著降低。此外，β-多样性分析表明，CDI组的细菌群落组成与其他组存在显著差异（PERMANOVA, p = 0.001），而CN、NCD和AC组具有相似的微生物群落结构。这些发现表明，真正感染的患者具有独特的肠道微生物群落，肠道微生物组可能是潜在的生物标志物来源。
在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）在所有组中相对丰度最高。与CN组相比，CDI组、AC组，尤其是NCD组中的变形菌门（Proteobacteria）丰度增加。此外，与CN组和NCD组相比，CDI组和AC组在门水平上拟杆菌门（Bacteroidota）增加，放线菌门（Actinobacteriota）减少。在属水平上（丰度前10），与CN组相比，NCD、CDI和AC组中乳酸杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）的相对丰度降低，而埃希氏菌属（Escherichia）、克雷伯菌属（Klebsiella）和链球菌属（Streptococcus）的相对丰度增加。
3.3 微生物相关性网络分析
在属水平（相对丰度>0.1%）构建微生物共现网络以显示物种间的相互作用。网络分析结果突出了四组之间相互作用特性的差异。与CN组相比，NCD组和CDI组具有更少的节点数和连接数。此外，NCD组和CDI组也显示出降低的平均度和较低的负相互作用比例，表明这两组中的细菌相互作用较弱。AC组具有更多的连接数和更高的平均度，然而，与CN组相比，AC组的负相互作用比例降低。CDI组与其他组相比具有不同的网络结构，表现为节点数和连接数更少、平均度降低以及模块性更高。这些结果表明CDI组中的细菌相互作用要弱得多。
3.4 生物标志物识别与评估
为了探索能够区分真正感染和无症状定植的生物标志物，使用LEfSe分析探索了AC组和CDI组之间最具判别性的细菌。进化分支图显示了AC组和CDI组之间的76个判别性特征。一些已知和潜在的益生菌，包括双歧杆菌属（Bifidobacterium）、粪杆菌属（Faecalibaculum）和臭杆菌属（Odoribacter），在CDI组中显著减少，而小杆菌属（Dialister）、巴斯德菌属（Pasteurella）、假单胞菌属（Pseudomonas）和韦荣球菌科（Veillonellaceae）在CDI组中富集。
接下来，根据上述标准对所有CDI患者进行疾病严重程度评估，并分析与CDI疾病严重程度相关的菌属。总共有46个属与严重程度评分显著相关，其中14个与严重程度评分呈正相关，32个呈负相关。其中，臭杆菌属（Odoribacter）与CDI严重程度评分的负相关性最强，表明其丰度可能与CDI疾病进展相关。随后，分析了臭杆菌属在四组中的丰度。一致地，我们发现与CN、NCD和AC组相比，CDI组中臭杆菌属的丰度显著降低。
3.5 臭杆菌与艰难梭菌在共培养系统中的相互作用
为了确定臭杆菌是否影响艰难梭菌的关键致病表型，包括细菌生长、孢子形成和毒素产生，我们选择了标准菌株O. splanchnicus ATCC 29572（OS），并建立了具有不同细菌浓度比例的CD-OS共培养系统，并量化了两种菌株的比例。首先确定了CD和OS在单培养中的生长动力学。与CD相比，OS的生长曲线特点是延滞期较长。我们注意到CD培养物的吸光度在12小时后开始持续下降，这可能表明孢子形成的开始。共培养系统的结果显示，在所有共培养系统中，OS的细菌载量最终稳定在5×108CFU/mL。然而，艰难梭菌的最终细菌载量在1:9（CD:OS）比例的系统中显著降低。相比之下，在1:1和9:1比例的系统中，CD载量保持稳定，约为7×107CFU/mL。还评估了两种物种随时间变化的组成比例。数据显示，CD的比例逐渐增加直至18小时，之后持续下降。这种逆转最终导致OS在所有系统中在30小时时占主导地位。
3.6 高浓度臭杆菌抑制艰难梭菌的毒素产生
接下来研究了OS对CD毒素产生的影响。通过ELISA对培养上清液中的毒素水平进行了时间进程分析。在12小时时间点，任何培养组中均未检测到毒素积累，水平低于检测限。到24小时，在CD单培养和CD:OS = 9:1共培养中检测到毒素，而在CD:OS = 1:1和1:9组中仍无法检测到。48小时时出现显著差异，CD单培养中的毒素滴度达到约8 μg/L，显著高于所有共培养条件。在72小时时，只有CD:OS = 1:9共培养与CD单培养相比，毒素水平保持了统计学上的显著降低。CD:OS = 9:1和1:1组中的毒素水平，尽管数值上较低，但与单培养对照相比无显著差异。
为了阐明这种抑制的分子机制，通过qPCR在相应时间点定量了毒素基因tcdA和tcdB的表达。在早期的12小时时间点，所有共培养组中tcdA和tcdB的表达均显著低于CD单培养。在后续时间点，共培养中的tcdA表达与单培养相比无显著差异。相比之下，在24小时时， specifically在CD:OS = 1:9和1:1共培养中观察到tcdB的持续转录抑制，其表达与CD单独对照相比仍显著受到抑制。
为了验证释放的是功能性毒素，使用在12、24、48和72小时收集的培养上清液进行了Vero细胞毒性试验。形态学分析揭示了清晰的时间依赖性和共培养依赖性细胞病变效应。12小时时间点的上清液（包括CD单培养的上清液）与阴性对照相比未引起Vero细胞明显的形态学变化。暴露于24小时上清液导致初始细胞圆缩，在经CD单培养上清液处理的细胞中比在经共培养上清液（CD:OS = 9:1, 1:1, 1:9）处理的细胞中更为严重，后者有更大比例的细胞保持贴壁。经48小时，特别是72小时上清液处理导致广泛的细胞圆缩和脱壁。值得注意的是，暴露于CD单培养72小时上清液的细胞显示出大量死亡。在这些后期时间点，经CD:OS = 1:9共培养上清液处理的细胞的细胞病变效应始终最轻微。
3.7 臭杆菌在较早阶段促进艰难梭菌的孢子形成
进一步评估了不同共培养条件下CD孢子形成的动态。利用孢子的乙醇耐受性，在不同时间点收集培养物，并通过平板计数量化活孢子。结果表明，在早期的12小时时间点，任何组中均未检测到显著的孢子形成。尽管在CD:OS = 1:9组的某些重复中观察到痕量孢子，但生物学重复间的高变异性阻碍了统计学显著性。到24小时，所有共培养组（CD:OS = 9:1, 1:1, 1:9）中的孢子计数均显著高于CD单培养。在随后的48小时和72小时时间点，所有组中的总孢子数量增加，其中CD:OS = 1:9共培养 consistently 产生最高的孢子计数。
4 讨论
肠道菌群失调与艰难梭菌感染（CDI）之间的关联已得到充分证实。与先前研究一致，我们发现与非感染人群（无论是否携带艰难梭菌）相比，CDI患者表现出显著的物种丰富度降低和最低的α-多样性指数。此外，β-多样性和共现网络分析证实，CDI组的整体微生物群落结构与其他三组显著不同，表明存在与感染相关的独特微生物结构。与既往研究一致，CDI中潜在益生菌如乳酸杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）的相对丰度降低，而埃希氏菌属（Escherichia）、克雷伯菌属（Klebsiella）的相对丰度增加。
既往研究表明艰难梭菌定植可改变肠道菌群，因此，为了识别不仅与艰难梭菌存在相关，而且特别与从定植到活动性疾病的关键转变相关的物种，我们随后将分析重点放在识别艰难梭菌无症状携带（AC）组和感染（CDI）组之间差异丰度的物种。在这些特定的微生物候选者中，O. splanchnicus被确定为与疾病严重程度负相关的关键物种。值得注意的是，最近一项研究揭示了O. splanchnicus在炎症性肠病（IBD）中的保护作用，通过其参与石胆酸（LCA）的转化来实现，这有助于缓解结肠炎并维持肠道屏障完整性。鉴于CDI主要表现为肠道感染和屏障破坏，这种已明确的机制可能至少部分解释了在我们队列中观察到的高OS丰度与较轻CDI症状之间的负相关。然而，O. splanchnicus是否对艰难梭菌有直接抑制作用尚未明确。
已有文献描述了不同细菌抑制艰难梭菌致病性的几种机制。例如，Kolling等人证明，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）通过分泌乳酸，在体外直接抑制艰难梭菌的生长以及TcdA毒素，乳酸发挥剂量依赖性的杀菌作用。另一项使用自动化厌氧体外发酵罐的研究表明，C. scindens的上清液含有分泌因子，可抑制艰难梭菌的生长及其TcdA和TcdB毒素的表达。与以生长抑制为中心的机制不同，我们的实验结果显示，与O. splanchnicus共培养并未显著抑制艰难梭菌的生长，后者在6至18小时之间表现出强劲的增殖。这一结果与先前一项采用培养组学方法构建菌株库以识别抑制艰难梭菌物种的研究一致，该研究也分离了O. splanchnicus并同样报告了对艰难梭菌生长无抑制作用，这与我们的观察一致。因此，综合证据表明，O. splanchnicus对艰难梭菌致病性的缓解并非通过抑制营养细胞的生长来实现。
我们进一步证明，O. splanchnicus以时间依赖性方式抑制艰难梭菌毒素产生，尤其是TcdB毒素，在最高初始O. splanchnicus比例（CD:OS = 1:9）时效果最为明显。最显著的减少发生在稳定期（48-72小时），这与单培养中毒素产生的高峰期相吻合。同时进行的qPCR分析揭示，抑制始于转录水平。在具有高初始O. splanchnicus比例的共培养中，在早期和中期时间点（12-24小时） specifically观察到tcdB表达的显著下调。这种早期的转录抑制为随后在稳定期后期检测到的毒素蛋白水平降低提供了直接的分子解释。然而，我们发现毒素水平在72小时时在共培养组（CD:OS = 1:1和9:1）中均有所增加，其水平与艰难梭菌单培养相比无统计学显著差异。并且这种增加伴随着CD:OS = 9:1组中tcdB基因表达的显著上调。我们提出，这种毒力后期的复苏很可能源于O. splanchnicus代谢活性随着共培养进入稳定期后期而下降。这种动态与基本生态学原理一致，即共生菌的保护功能与其在生态位内的丰度和活性密切相关。例如，C. scindens必须达到足够的丰度才能产生抑制性次级胆汁酸。类似地，O. splanchnicus可能需要持续水平的代谢活性来持续抑制艰难梭菌的毒素产生，可能通过营养竞争实现。
同时，我们观察到共培养系统中艰难梭菌孢子形成的显著增加，在24小时时间点尤为明显。这种表型转变与艰难梭菌已明确的调控回路相一致，其中毒素产生和孢子形成受到环境线索（如营养可用性）的协同影响。与肠道共生菌共培养会对艰难梭菌施加营养压力，竞争者消耗优先的碳源和氮源可以改变代谢环境，从而加速孢子形成。因此，我们提出O. splanchnicus可能加速艰难梭菌营养细胞向休眠孢子的转变，从而导致观察到的毒素产生减少。然而，孢子形成增强和毒素抑制效应都随时间呈现动态变化。到72小时时间点，共培养组与艰难梭菌单培养之间的孢子计数差异不再具有统计学意义。我们将这种趋同，以及之前提到的毒素产生后期的反弹，主要归因于O. splanchnicus代谢活性随着共培养进入稳定期后期而下降。这一观察结果强调，OS的抗毒力效应不是静态的，而是取决于其在生态位内持续的代谢活性。
同时，OS增强艰难梭菌孢子形成的潜在流行病学意义需要仔细考量。从传播角度看，孢子产生的增加理论上可能提高艰难梭菌在医疗环境中的环境持久性和传播，因为孢子是主要的、高度耐久的传播载体。然而，必须在更细致和全面的框架内评估这种潜在风险。关键的是，O. splanchnicus同时显著抑制毒素产生，这直接降低了宿主的疾病严重程度和症状性腹泻。由于
