《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Effects and mechanisms of iron overload on the proliferation and differentiation of preosteoblastic cells via a 3D microsphere culture system
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本研究通过构建甲基丙烯酰化明胶（GelMA）微球三维培养系统，模拟铁过载条件下骨微环境，系统揭示铁过载通过抑制整合素ITGA1/ITGB1表达、破坏细胞骨架完整性并激活氧化应激，进而抑制前成骨细胞成骨分化的新机制。三维培养通过下调Hippo、黏着斑等机械信号通路，增强细胞抗氧化能力，为铁过载相关骨质疏松的微环境靶向治疗提供新策略。
1 引言
骨质疏松症是以骨量减少、骨微结构退化为特征的常见骨骼疾病，全球影响超2亿人。铁作为必需微量元素，过量积累会通过芬顿反应产生活性氧（ROS），导致骨形成抑制和骨吸收增强。传统二维培养难以模拟细胞外基质微环境，本研究利用GelMA微球构建三维培养体系，探究铁过载对前成骨细胞功能的影响。
2 材料与方法
2.1 GelMA微球制备
通过微流控技术合成直径500±50 μm的GelMA微球，其弹性模量（31.03 kPa）近似早期骨质疏松骨组织。核磁共振氢谱显示甲基丙烯酰取代度为64.7%。
2.2 细胞实验设计
将小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）分别接种于二维培养板（TCP组）和GelMA微球（GM组），添加柠檬酸铁铵（FAC，300 μM）模拟铁过载。通过CCK-8、活死染色、流式细胞术、ROS检测及RNA测序等多维度评估细胞行为。
3 结果与讨论
3.1 三维微球增强细胞铁耐受性
铁过载显著降低二维细胞活力（TCP+FAC存活率70%），而三维培养（GM+FAC）存活率达95%。活死染色显示GM+FAC组死细胞比例显著低于TCP+FAC组（图2A、2C）。三维微球通过孔隙结构促进营养交换，维持细胞增殖活性（图2E）。
3.2 调控氧化应激与凋亡
铁过载诱导二维细胞ROS水平升高75%（图2B、2D），而三维细胞仅升高50%。流式细胞术显示GM+FAC组凋亡率（12.60%）显著低于TCP+FAC组（17.45%），且G1期阻滞程度更轻（图2F-J）。
3.3 整合素-细胞骨架信号重编程
免疫荧光显示铁过载破坏二维细胞ITGA1/ITGB1表达和F-肌动蛋白网络（图3A-E）。三维培养中细胞呈现交织状骨架结构，整合素表达基线较低，受铁过载影响较小。qPCR证实GM组黏附相关基因（ITGA1、ITGB1、YAP1等）表达下调，且铁过载后降幅更缓（图3F-G）。
3.4 成骨功能保护机制
三维培养显著缓解铁过载对成骨标志物（OCN、OPN）的抑制（图4A-D）。ALP活性、胶原沉积和钙结节形成在GM+FAC组均优于TCP+FAC组（图4E-J），表明三维微环境通过维持细胞-基质相互作用支持成骨分化。
3.5 转录组机制解析
RNA测序揭示三维培养上调DNA复制、NF-κB通路，下调Hippo、Wnt等机械信号通路（图5）。铁过载时，三维细胞通过激活谷胱甘肽代谢增强抗氧化能力，而二维细胞则显著富集铁死亡通路（图6）。整合素-细胞骨架-抗氧化轴的核心调控网络如图7所示。
4 结论
GelMA微球三维系统通过调控ITGA1/ITGB1介导的机械信号通路，增强前成骨细胞对铁过载的抵抗能力，为骨质疏松病理机制研究和靶向治疗提供新模型。
