萎缩芽孢杆菌YL84发酵滤液对棉花枯萎病菌的抑菌机制及代谢产物分析

《Frontiers in Microbiology》：Evaluation of the inhibitory effect of the cell-free fermentation filtrate of Bacillus atrophaeus YL84 on Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum and analysis of its metabolic products

本综述系统评估了萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）YL84菌株的无细胞发酵滤液（CFFF）对棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum, FOV）的抑制效果及其作用机制。研究表明，YL84 CFFF能显著抑制FOV菌丝生长（75.68%）和分生孢子萌发（77.56），并通过破坏细胞膜完整性（核酸泄漏、MDA含量升高）和诱导植物系统抗性（SOD、POD、CAT酶活性上调）发挥双重防控作用。其抑菌活性对高温、紫外线和盐胁迫具有良好稳定性，UPLC-IMS-Q-TOF-MS分析揭示滤液中富含萜类、生物碱等多种潜在抗菌物质，为开发新型生物农药提供了理论依据。

　　

1 引言

棉花（Gossypium hirsutum L.）作为全球重要经济作物，其生产常受土壤传播的棉花枯萎病威胁，该病害由尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum, FOV）引起，导致幼苗死亡和纤维品质下降。现有防治手段如化学杀菌剂易引发抗药性和环境问题，而生物防治因其环境友好性成为研究热点。芽孢杆菌属（Bacillus spp.）因其适应性强、作用模式多样，被广泛用于植物病害防控。本研究以实验室前期从健康库尔勒香梨叶片分离的萎缩芽孢杆菌YL84为对象，系统评估其无细胞发酵滤液（CFFF）对FOV的抑制潜力、环境稳定性及代谢组分，为开发高效生物防治剂提供依据。

2 材料与方法

2.1 菌株与培养基

FOV菌株分离自新疆染病棉花根部，经柯赫氏法则验证其致病性；YL84菌株通过形态学、生理生化及16S rDNA鉴定确认。实验采用LB和PDA等培养基（详见表1）。

2.2 拮抗活性测定

采用平板对峙法，将YL84点接于距FOV菌饼30 mm的PDA平板上，27°C培养5天后测量菌落直径，计算抑菌率（公式略）。结果显示YL84对FOV的抑菌率达81.06%。

2.3 CFFF对孢子萌发和菌丝生长的抑制

将YL84发酵液离心过滤获得CFFF，稀释后与FOV孢子（1×10⁷spores/mL）混合，36小时后观察萌发率。菌丝生长抑制实验通过添加不同体积分数（2%–10%）CFFF至PDA培养基，测量菌落直径。结果表明，未稀释CFFF对孢子萌发和菌丝生长的抑制率分别为77.56%和75.68%，且呈浓度依赖性。

2.4 细胞膜完整性评估

用CFFF处理FOV菌丝后，检测260 nm吸光度（核酸泄漏指标）和丙二醛（MDA）含量。未稀释组处理8小时后A₂₆₀达0.83，24小时后MDA含量为对照的2.05倍，表明CFFF破坏细胞膜结构。

2.5 抑菌活性稳定性

CFFF经不同pH（3.0–11.0）、温度（20°C–100°C）、紫外线（10–50 min）和NaCl浓度（1%–5%）处理后，测定其抑菌活性保留率。结果显示，该滤液对高温（100°C后活性保留25.88%）、紫外线（50 min后活性59.65%）和中等盐浓度（2% NaCl下抑制率76.59%）具有耐受性，但对强碱（pH 11.0）敏感。

2.6 盆栽实验与抗性诱导

在温室盆栽实验中，用CFFF灌根处理接种FOV的棉花幼苗（品种“塔河2号”），21天后评估病情指数。未稀释CFFF对枯萎病的防治效果达69.21%。同时，叶片防御酶（SOD、POD、CAT）活性显著升高，其中SOD活性为对照的1.98倍，表明CFFF可诱导植物系统抗性。

2.7 代谢组分分析

通过超高效液相色谱-离子淌度-四极杆飞行时间质谱（UPLC-IMS-Q-TOF-MS）非靶向代谢组学分析，从CFFF中推定鉴定出多种潜在抗菌物质，包括二萜苷类（如伪金酸-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）、柠檬苦素类（如川楝素C/E）、生物碱（如血根碱）及酚酸类（如没食子酸）等。这些化合物可能通过协同作用增强抑菌效果，其中甾体皂苷（如重楼皂苷IV）等膜活性物质或通过增加细胞膜通透性促进其他成分进入菌体。

3 结果与分析

YL84对FOV的平板对峙抑制率为81.06%（图1）。CFFF在未稀释时对孢子萌发和菌丝生长的抑制效果最强，稀释后活性逐渐降低（图2–4）。膜完整性实验显示核酸泄漏和MDA含量随CFFF浓度增加而上升（图5–6）。稳定性方面，CFFF在酸性、高温、紫外及中低盐条件下保持较高活性，但在pH 11.0时完全失活（图7）。盆栽实验中，CFFF的防治效果与浓度正相关，且能显著激活棉花防御酶系统（图8）。代謝組分分析揭示CFFF中富含结构多样的抗菌前体物质（图9、表3）。

4 讨论

本研究证实YL84 CFFF通过直接破坏病原菌细胞膜和诱导植物抗性双重途径抑制FOV。其抑菌活性在新疆地区高温、高紫外及盐渍化环境下展现良好稳定性，与已报道的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）等菌株的耐受性一致。代谢组学分析提示CFFF中多种推定标识的化合物（如二萜类、生物碱）可能共同贡献其抗菌活性，但需通过标准品进一步验证各组分功能。

5 结论

萎缩芽孢杆菌YL84的无细胞发酵滤液对棉花枯萎病菌具有显著抑制作用，且对环境胁迫具有较强耐受性。其作用机制涉及细胞膜损伤和植物抗性诱导，代谢产物分析为开发靶向生物农药提供了候选分子基础。后续研究需通过单体化合物验证和田间试验明确其应用潜力。