动态颗粒水凝胶评估胰腺癌细胞命运的创新平台

《Biomaterials Science》：Dynamic granular hydrogels to assess pancreatic cancer cell fate

本文开发了一种基于明胶-降冰片烯-碳酰肼（GelNB-CH）微凝胶的动态颗粒水凝胶平台，通过微流控液滴生成、反电子需求狄尔斯-阿尔德（iEDDA）点击反应退火和腙键动态硬化，实现了对胰腺癌相关成纤维细胞（CAF）扩散和癌细胞（PCC）迁移的可控研究。该平台能模拟肿瘤微环境（TME）的动态刚度变化（如剪切模量G′从～2 kPa增至～8 kPa），且不改变空隙率（～35%），为体外癌症建模提供了高度适配的生物材料工具。

　　

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）占胰腺癌病例的90%，其五年生存率在2025年仅为13%。PDAC的肿瘤微环境以细胞外基质（ECM）过度沉积为特征，导致基质刚度升高（健康胰腺组织剪切模量G′～1 kPa，癌变组织显著更高），限制治疗药物渗透。癌症相关成纤维细胞（CAF）是基质沉积的主要细胞，与胰腺癌细胞（PCC）相互作用调控细胞命运。现有水凝胶模型（如聚乙二醇-降冰片烯（PEGNB）或明胶-甲基丙烯酸酯（GelMA））虽能模拟刚度变化，但多为介孔结构（孔径数十纳米），限制大分子运输和细胞迁移。颗粒水凝胶通过微米级微凝胶组装形成大孔支架，克服了这一局限，但多数系统缺乏动态可调性。本研究利用GelNB-CH的多重正交反应（硫醇-降冰片烯光点击、iEDDA点击、腙键结合），开发了动态颗粒水凝胶平台。

材料与方法

GelNB-CH合成自明胶，通过碳酰酐和碳酰肼修饰，分别引入降冰片烯（NB）和碳酰肼（CH）基团（NB取代度5.1–5.4 mM per wt%，CH取代度3.5–4 mM per wt%）。微凝胶通过微流控液滴芯片生成，水相（含GelNB-CH、PEG4SH和光引发剂LAP）与油相（Novec 7500含2% Pico-Surf）在特定流速下形成液滴，经365 nm光（5 mW cm^?2，2分钟）交联。微凝胶直径（～140–352 μm）和分散性（PDI～0.01–0.1）受聚合物浓度和流速调控，最优参数为5 wt% GelNB-CH、1 wt% PEG4SH、水相流速18 μL min^?1、油相流速90 μL min^?1。颗粒水凝胶通过PEG4Tz与微凝胶残留NB基团的iEDDA反应退火形成，再经氧化葡聚糖（oDex）处理动态硬化（oDex浓度0.0125–0.1 wt%）。力学性能通过流变仪和微压痕仪评估，细胞实验使用胰腺CAF和Pa03C癌细胞系，以球体形式嵌入支架。

结果与讨论

GelNB-CH水凝胶交联与动态硬化：硫醇-降冰片烯光点击反应实现快速凝胶化（凝胶点10–30秒），凝胶刚度可通过聚合物和交联剂含量独立调控（剪切模量G′～500–5000 Pa）。oDex通过腙键与GelNB-CH的CH基团反应，使凝胶刚度在48小时内提升4倍（至～8000 Pa），且呈现应变软化行为，表明动态键合形成。

微凝胶制备与优化：微流控参数显著影响微凝胶均一性。提高水相粘度（如10 wt% GelNB-CH溶液粘度～189 mPa s）会增大微凝胶尺寸和PDI。优化后微凝胶（5 wt% GelNB-CH, 1 wt% PEG4SH）直径～163 μm，PDI～0.01。oDex硬化后微凝胶直径减小至～100 μm（0.1 wt% oDex），但PDI保持稳定（～0.008–0.01）。

颗粒水凝胶退火与硬化：iEDDA退火后，oDex均匀渗透至支架内部（通过CF488A-oDex荧光验证），空隙率保持～35%。动态硬化不改变空隙结构，但提升整体刚度，模拟PDAC进展中的基质硬化（2–10 kPa）。

CAF和PCC球体行为：在软颗粒水凝胶中，CAF从球体快速扩散（4天后最大投影面积>50,000 μm²），而硬化支架（0.1 wt% oDex）限制CAF扩展（面积～20,000 μm²）。二维培养显示，软凝胶上CAF呈纺锤形（F-肌动蛋白束明亮），硬凝胶上细胞更圆（黏附更稳定）。在PCC球体与分散CAF共培养中，CAF形成网络并诱导PCC迁移，但硬化未显著影响PCC扩散面积。这表明CAF对刚度敏感，而PCC迁移更依赖CAF的旁分泌作用（如TGFβ、FGF），而非直接力学响应。

结论

本研究建立了动态颗粒水凝胶的标准化工作流程，通过正交化学反应实现微凝胶制备、退火和动态硬化的精准控制。该平台成功模拟了PDAC微环境中基质刚度时空变化，揭示CAF扩散受硬化抑制，而CAF介导的PCC迁移不受刚度直接影响。未来可整合细胞因子或物理胁迫，进一步解析PDAC机制。