锌离子与氧调控协同提升米曲霉产苹果酸：机制解析与过程强化策略

《Biotechnology and Bioengineering》：Influence of Zn2+ and Oxygen Supply on Malic Acid Production and Growth of Aspergillus oryzae

本研究系统揭示了在米曲霉（Aspergillus oryzae）发酵生产苹果酸（malic acid）过程中，锌离子（Zn2+）耗竭是限制生长的关键因素，并通过呼吸活性监测结合脉冲补料策略，首次明确了Zn2+补充诱导的缺氧（hypoxia）状态可显著提升苹果酸产量至45.28?g?L-1，产量达0.61?g?g-1葡萄糖。研究进一步通过调控容积氧传递系数（kLa）与pH（7.00），实现了有机酸谱向苹果酸定向富集，为微生物平台化学品的高效合成提供了过程优化新范式。

　　

锌离子与氧供应对米曲霉生长及苹果酸生产的影响

摘要

苹果酸是一种重要的平台化学品，传统上依赖于化石资源。利用米曲霉进行微生物培养，基于可再生原料提供了可持续的替代方案。本研究采用既往研究中为确保可重复性而广泛使用的最小培养基，通过呼吸监测结合逐步营养脉冲，意外发现培养8小时后存在营养耗竭。通过呼吸监测和系统逐步营养脉冲的组合，鉴定出锌离子（Zn²⁺）限制。补充Zn²⁺增加了氧消耗，导致缺氧条件。这种诱导的缺氧增强了苹果酸生产并影响了整体有机酸谱。测试了不同的动态氧浓度策略以评估其对苹果酸生产率的影响，结果表明，允许生长进入缺氧状态并在整个生产阶段维持缺氧，能获得最佳性能。通过结合Zn²⁺补充、维持培养pH为7.00以及Zn²⁺诱导的缺氧，最终苹果酸浓度从31.44?g?L^-1提升至45.28?g?L^-1，产量为0.61?g苹果酸每克葡萄糖，平均生产率为0.19?g?L^-1h^-1。

1 引言

苹果酸及其前体马来酸酐目前是从苯和丁烷等化石原料中作为外消旋体生产的。年产量10.5万吨的苹果酸在食品和饮料工业中用作酸味剂和调味剂，化妆品产品中的缓冲剂，清洁剂中的螯合剂以及药物配方中的添加剂。然而，化石资源可预见的枯竭以及石油化工合成的环境缺点强调了对平台化学品进行生物基生产的需求。微生物培养不仅依赖于可再生原料，而且产生对映体纯的苹果酸，消除了基于富马酸酶的对映体纯化成本。米曲霉是微生物生产苹果酸研究中常用的真菌，其广泛的底物谱适用于农业工业副产物的利用。该子囊菌在工业水解酶、酱油、清酒和味噌生产中的长期使用说明了其技术可扩展性及其作为公认安全（GRAS）生物体，特别适用于食品相关应用。

有氧培养的优化通常受益于通过连续测量溶解氧张力（DOT）和尾气成分以确定氧（OTR）和二氧化碳传递速率（CTR）来监测呼吸活性，从而实时了解培养进展和性能。然而，在米曲霉培养中监测呼吸活性以生产苹果酸的潜力尚未得到充分探索，部分原因是离线摇瓶（SF）实验的广泛使用以及常用碳酸钙（CaCO₃）作为中和剂的普遍做法。酸-碳酸盐反应过程中释放的二氧化碳难以与呼吸二氧化碳区分开来，使准确的代谢表征复杂化。因此，我们建立了用氢氧化钠（NaOH）中和的苹果酸生产，允许监测呼吸二氧化碳释放。

为了补充在线分析并确保一致的过程条件，本研究中的培养依赖于Abe等人于1962年首次发表的确定的最小培养基。使用该最小培养基并基于呼吸监测，培养过程可分为三个不同的阶段：在初始生长阶段，真菌在营养过剩条件下增殖，表现为DOT急剧下降，同时OTR和CTR增加。在第二阶段，DOT继续几乎线性下降，而OTR和CTR保持平台水平，表明从无限生长转向受限生长。第三阶段标志着向铵耗竭静止状态的过渡，表现为OTR和CTR逐渐下降。在此阶段，大多数有机酸被生产。基于我们先前研究的观察，其中第二阶段观察到的生长限制被假设为营养耗竭的结果，本研究旨在更详细地研究这一假设。

识别此类限制对于优化生物过程效率至关重要，但传统的分析方法通常需要耗时的后验分析来检测营养缺乏。在本研究中，我们利用DOT作为快速响应指标，通过在受限生长阶段脉冲培养基组分来识别观察到的生长限制的原因。脉冲实验期间的恒定氧气供应确保DOT的变化直接反映培养物的氧气消耗。这种方法允许立即区分营养充足和缺乏。

一旦识别出耗竭的营养素，就进行补充以缓解生长限制。由于恒定的氧气供应和补充引起的氧气需求增加，苹果酸在缺氧条件下生产。为了区分补充营养素和不同氧气可用性的影响，对所用反应器设置的容积质量传递系数（k_La）进行了表征，并对其进行操作以在存在和不存在补充营养素的情况下有意创建常氧和缺氧环境。本质上，本研究展示了一种快速简便的识别营养耗竭的方法，并强调了苹果酸生产的氧依赖性。

2 方法

2.1 微生物和培养基

使用米曲霉DSM 1863。所有培养基均使用去离子水制备。分生孢子生产与K?vilein等人描述的程序一致。米曲霉的孢子在最小培养基上进行，该培养基含有15 g L^-1葡萄糖一水合物、6 g L^-1NaNO₃、22.37 g L^-1KCl、0.52 g L^-1MgSO₄·7H₂O、1.52 g L^-1KH₂PO₄、15 g L^-1琼脂和2 mL L^-1的Hutner氏微量元素（HTE）。培养基的pH在使用氢氧化钠（NaOH）调整至6.5后，通过121°C高压灭菌20分钟进行灭菌。浓缩的微量元素溶液包含5 g L^-1FeSO₄·7H₂O、50 g L^-1Na₂EDTA、22 g L^-1ZnSO₄·7H₂O、11 g L^-1H₃BO₃、5 g L^-1MnCl₂·4H₂O、1.6 g L^-1CoCl₂·6H₂O、1.6 g L^-1CuSO₄·5H₂O和1.1 g L^-1(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，pH 6.5，并使用0.2 μm膜过滤器灭菌。孢子在30°C下发生6天。将所得分生孢子收集在50% (v/v) 甘油中，通过Miracloth过滤，使用血球计数器定量，并分装储存在-20°C。

用于预培养和主培养的培养基组成基于先前描述的程序。预培养培养基含有40 g L^-1葡萄糖一水合物、4 g L^-1(NH₄)₂SO₄、0.75 g L^-1KH₂PO₄、0.98 g L^-1K₂HPO₄、0.1 g L^-1MgSO₄·7H₂O、0.1 g L^-1CaCl₂·2H₂O、5 mg L^-1NaCl和5 mg L^-1FeSO₄·7H₂O。所有主要组分通过高压灭菌灭菌，而微量元素随后以2 mL L^-1HTE溶液的形式添加。在一个特定实验中，预培养培养基中HTE的添加被去离子水替代。这种缺乏HTE的生物质用于接种一个反应器重复。

对于主培养，培养基由120 g L^-1葡萄糖一水合物、1.2 g L^-1(NH₄)₂SO₄、0.1 g L^-1KH₂PO₄、0.17 g L^-1K₂HPO₄、0.1 g L^-1MgSO₄·7H₂O、0.1 g L^-1CaCl₂·2H₂O、5 mg L^-1NaCl和60 mg L^-1FeSO₄·7H₂O组成。为了灭菌，(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄和NaCl与100 μL消泡剂Contraspum A 4050 HAc一起高压灭菌，该消泡剂专门用于STR实验。葡萄糖一水合物单独高压灭菌，而FeSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O和MgSO₄·7H₂O进行无菌过滤。

2.2 预培养条件

预培养在含有100 mL培养基的500 mL带挡板摇瓶（SF）中进行，接种量为2 × 10⁵分生孢子 mL^-1。摇瓶在30°C、100 rpm、轨道直径25 mm下培养24小时。随后，使用Miracloth过滤收获所得生物质，并用去离子水冲洗。STR主培养接种7.5 g L^-1洗涤后的真菌生物质。

一个特定的STR重复接种了在预培养中用去离子水替代HTE体积的生物质。此外，还研究了微量元素补充对预培养中生物质生长的影响。在一个设置中，预培养照常补充2 mL L^-1HTE。在第二个设置中，添加相同体积的22 g L^-1ZnSO₄·7H₂O溶液代替HTE。在第三个设置中，与HTE对应的体积被去离子水替代。

2.3 主培养条件

STR培养在2.5 L生物反应器中进行，工作体积为1.4 L。所有培养在32°C下进行，使用两个直径为4.5 cm的Rushton涡轮。所有STR培养的操作设置如补充材料1所示。在特定培养中，k_La通过特定的搅拌和通气设置进行调整，以满足微生物的氧气消耗，从而产生常氧或缺氧条件。首先增加通气速率，仅在必要时调整搅拌频率以最小化剪切应力的潜在影响。常氧和缺氧条件基于DOT趋势进行操作定义，常氧条件以持续升高的DOT水平为特征，缺氧条件以DOT快速持续下降为指示。一些培养物在生长和生产过程中经历了DOT的受控转变，导致缺氧和常氧条件。所有培养均使用无菌空气通气。pH使用4 M NaOH和4 M H₃PO₄控制在6.50 ± 0.05。一个特定的培养维持在pH 7.00 ± 0.05。中和剂保存在天平上，能够根据记录的质量、密度和泵流量随时间计算消耗的体积。为了跨实验的可比性，中和剂体积除以初始培养体积1.4 L。用于pH控制的H₃PO₄添加体积极小，低于重量定量的检测限。pH传感器使用pH 4.00和7.00的标准缓冲溶液校准。DOT传感器使用100% N₂和100%空气进行两点校准。使用气体传感器进行尾气分析，使用空气校准，用于监测O₂和CO₂分压以及绝对湿度。为了最小化真菌在反应器表面的附着，省略了挡板。此外，应用凸面DOT传感器盖以减少生物质污染。为了避免喷雾器堵塞，通过一个带有4 mm直径单开口的弯曲金属管提供通气。下叶轮安装在搅拌轴末端上方1 cm处，与上叶轮的垂直距离为6.5 cm。通过抽取10 mL含有真菌生物质的培养液进行取样。在特定实验中，主培养培养基组成额外补充了2 mL L^-1HTE或2 mL L^-1的22 g L^-1ZnSO₄·7H₂O溶液。培养条件概述见表1。大多数STR培养进行生物学重复，而脉冲实验在较短时间内进行单次培养。

2.4 营养脉冲实验

为了研究受限生长期间营养脉冲的影响，将单个反应器培养物生长至营养耗竭阶段，操作条件等同于参考培养。脉冲营养物的量对应于初始供应量的50%，遵循主培养培养基的方案，或匹配1 mL L^-1HTE中存在的浓度。应注意，脉冲的微量元素溶液在每次添加前新鲜制备，省略了HTE中使用的EDTA。

2.5 k_La测定

采用排气法测定k_La。最初，向系统中引入N₂以建立缺氧条件。随后，应用各种通气速率和搅拌频率组合以捕捉本研究普遍条件的操作窗口。k_La使用方程1从DOT的变化计算，当前操作条件下的氧饱和浓度为7.10 mg L^-1，为测量的氧浓度。

应注意，k_La测定在非生物条件下进行，真菌聚集体可能在培养过程中改变k_La。

2.6 分析

STR实验的样品通过0.5 mm筛网过滤，保留的固体用去离子水冲洗，在2400 dpi下扫描，在80°C下干燥至少2天，并称重以确定细胞干重（CDW）。该方法也用于测定研究不同微量元素补充效果的预培养实验中的CDW。STR样品的滤液在-20°C冷冻用于代谢物分析。用于碳追踪的米曲霉生物质组成先前已发表。

使用Spectroquant检测试剂盒光度法测定铵浓度，遵循制造商方案。测定微型化至总体积200 μL，并在微孔板中使用每个反应器的滤液进行，单次测量。

用于代谢物定量的方案改编自K?vilein等人，并由Hartmann等人先前发表。STR实验的滤液用0.66 M H₂SO₄稀释10倍，在80°C、1000 rpm、轨道直径3 mm下孵育20分钟，并在17,000 × g下离心5分钟。所得上清液使用标准HPLC系统进行分析，配备Rezex ROA Organic Acid H+ (8%)分析柱和保护柱。使用5 mM H₂SO₄作为流动相，流速0.5 mL min^-1，进样体积10 μL，柱温30°C进行等度分离。葡萄糖通过折光指数检测器检测，而有机酸使用UV检测器在220 nm处定量。

2.7 计算

使用的软件以及代谢物质平衡、时间依赖性培养体积和气体传递速率的计算先前已发表。定量考虑取样、中和和蒸发引起的体积变化，以避免稀释效应。基于尾气中的绝对湿度确定蒸发，而OTR、CTR和呼吸商（RQ）根据Knoll等人在单独研究中建立并由Hartmann等人描述的尾气组成计算。气体传递速率和代谢物质量除以初始培养体积，实现不同培养条件之间的直接比较。基于从葡萄糖转化分配到不同产物的消耗碳分数评估产物选择性。计算有机酸的总摩尔生产率以量化和比较它们的整体形成。

使用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接Tukey事后检验评估不同预培养补充条件产生的CDW值的统计显著性。差异在p < 0.05时被认为弱显著，在p < 0.01时显著，在p < 0.001时强显著。

3 结果

3.1 生长限制营养素的识别

为了识别潜在的耗竭营养素，复制了先前发表的参考培养，直至受限生长阶段开始。然后，依次脉冲单个培养基组分。根据假设，添加耗竭的营养素应缓解生长限制并恢复呼吸活性。如图1A所示，添加主培养基中存在的所有营养素后，呼吸活性保持不变。添加存储在H₂SO₄中的FeSO₄·7H₂O (5) 后DOT的短暂下降很可能归因于pH稳态能量需求增加导致的氧气消耗短期增加。这一理论也解释了添加新鲜制备的不含H₂SO₄的FeSO₄·7H₂O (8) 后缺乏DOT下降的原因。因此，限制营养素来源于主培养基以外的来源。由于HTE中的微量元素是接触生物质的唯一其他组分，即使在预培养收获后洗涤菌丝体后也是如此，因此HTE被认为是耗