《Journal of Bone Oncology》：Efferocytosis-associated transcriptomic patterns characterize prognosis and immune landscape in osteosarcoma
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本研究针对骨肉瘤异质性高、预后差的临床难题，聚焦胞葬作用（Efferocytosis）在肿瘤免疫微环境中的关键作用。研究人员通过整合多组学数据与机器学习方法，构建了稳健的预后特征，并发现MAGEA11通过Gas6-MERTK/AXL轴驱动巨噬细胞M2极化的新机制，为骨肉瘤的免疫治疗提供了新的潜在靶点。
在儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤——骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）面前，医学界正面临着一个严峻的挑战。尽管新辅助化疗和手术切除的结合已将局部骨肉瘤的5年生存率提升至60-75%，但这一数字在过去几十年里陷入了停滞。更令人担忧的是，发生转移或复发的患者，其5年总生存率仅为20-30%。这种治疗瓶颈的背后，是骨肉瘤极高的异质性和复杂的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME），使得开发新的、基于机制的疗法变得尤为迫切。
近年来，科学家们将目光投向了一个看似矛盾的生命过程——胞葬作用（Efferocytosis）。简单来说，这是指免疫细胞对凋亡细胞的吞噬清除，本是维持组织稳态、抑制过度炎症反应的重要机制。然而，在肿瘤的“领地”里，这一过程却可能“叛变”，促进免疫耐受和肿瘤进展，成为一种“双面刃”。特别是在骨肉瘤中，已有证据表明，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）通过MerTK受体介导的胞葬作用，会极化为M2表型（一种促进肿瘤生长的巨噬细胞亚型），并上调PD-L1的表达，从而帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击。这提示我们，胞葬作用可能是塑造骨肉瘤免疫微环境、影响疾病进程的一个关键环节。为了深入解析这一过程，并挖掘其临床价值，由宋学亮、申家宏等研究人员组成的团队在《Journal of Bone Oncology》上发表了一项综合性研究。
为了系统揭示胞葬作用在骨肉瘤中的作用，研究人员运用了多层次的技术策略。他们首先整合了TARGET-OS队列作为训练集，并收集了三个GEO数据集（GSE16091, GSE21257, GSE39055）作为验证队列，通过生物信息学方法校正批次效应。利用单样本基因集富集分析（ssGSEA）量化胞葬作用通路活性，并通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与胞葬作用最相关的基因模块（棕色模块）。随后，结合单变量Cox回归和多种机器学习算法（包括StepCox、Ridge回归、随机生存森林等）筛选关键基因并构建预后特征。研究还综合运用了差异表达分析、功能富集分析（KEGG、GO）、多种算法（如MCPcounter, quanTIseq, xCell等）评估免疫细胞浸润，并利用TIDE和SubMap算法预测免疫治疗反应。在实验验证层面，研究分析了六个骨肉瘤患者的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据和公共空间转录组数据（样本SP_BS3），并通过体外细胞实验（包括细胞增殖、迁移、凋亡、巨噬细胞极化、ELISA等）和体内小鼠异种移植模型，深入探究了关键基因MAGEA11的功能及其分子机制。
3.1. 整合多OS队列并识别胞葬作用相关模块
研究人员成功整合了多个骨肉瘤转录组数据集。主成分分析（PCA）显示，经过ComBat算法校正后，不同GEO数据集间的批次效应被有效消除。ssGSEA分析表明，与正常组织相比，骨肉瘤样本中的胞葬作用及其调控通路（正调控、负调控）活性显著上调，并且在转移性骨肉瘤中高于非转移性骨肉瘤，提示增强的胞葬作用可能与OS的进展和转移相关。WGCNA分析鉴定出的棕色模块与所有胞葬作用相关通路的关联最为显著和一致，因此被选为后续分析的重点。
3.2. 基于机器学习的胞葬作用相关预后特征的开发与验证
通过对棕色模块基因和胞葬作用相关基因进行单变量Cox回归分析，筛选出候选预后基因。在比较了多种机器学习算法后，StepCox[both] + Ridge模型表现出最佳的预测性能和稳定性。基于该模型计算的风险评分，能够将患者显著分为高风险和低风险两组，高风险组患者的总生存期更短。时间依赖性ROC曲线分析进一步证实了该模型在1年、3年和5年生存期预测中均具有良好的准确性（AUC值均大于0.7）。
3.3. 差异表达基因的识别与功能表征
研究在训练集和验证集中共同鉴定出291个下调基因和213个上调基因。功能富集分析显示，上调基因主要富集于Hippo信号通路、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用等通路，并与一氧化氮信号、内皮细胞发育、胶原组织等生物过程相关。而下调基因则与JAK-STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路相关，并参与ERK1/ERK2级联调控、受体配体活性等过程。这表明胞葬作用相关特征与细胞外基质调控、免疫信号和内皮功能改变密切相关。
3.4. 与胞葬作用风险模型相关的免疫浸润和免疫治疗反应
综合免疫浸润分析发现，高风险组中M2型巨噬细胞的浸润水平在不同算法中均一致升高。同时，高风险组表现出独特的免疫检查点基因表达谱。相关性分析确认，模型中的六个基因（GABRA3, GCG, MAGEA11, PAGE1, FPR1, MAGEA4）均与M2巨噬细胞浸润呈正相关。利用TIDE算法预测显示，高风险组患者有更高比例可能从免疫检查点阻断治疗中获益，其TIDE评分和T细胞功能障碍水平较低。SubMap分析也支持高风险组与已知的免疫治疗应答模式更相似。
3.5. 骨肉瘤中胞葬作用相关基因的单细胞转录组图谱
通过分析六个骨肉瘤患者的scRNA-seq数据，研究揭示了主要细胞群落的组成。胞葬作用评分在骨肉瘤细胞中富集程度最高。细胞通讯分析（CellChat）表明，高风险样本中细胞间相互作用的总强度和数量均高于低风险样本。骨肉瘤细胞是主要的信号枢纽，在高风险组中，其与内皮细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）以及免疫细胞（尤其是巨噬细胞）的通讯显著增强。这描绘了一幅由恶性细胞主导的、促进免疫抑制的微环境互动图景。
3.6. 骨肉瘤中胞葬作用相关特征的空间转录组图谱
对空间转录组样本SP_BS3的分析显示，胞葬作用评分在肿瘤区域和肿瘤-基质界面区域显著高于单纯的基质区域。相关性分析进一步表明，胞葬作用水平与骨肉瘤细胞、CAFs和巨噬细胞的丰度呈正相关，而与T细胞呈负相关。这从空间层面证实了胞葬作用活跃的区域与免疫抑制性细胞聚集、T细胞排斥的微环境特征相关联。
3.7. MAGEA11增强骨肉瘤细胞系的细胞活力
功能实验发现，在高侵袭性骨肉瘤细胞系U2OS中，MAGEA11的表达高于低转移性细胞系MG-63。在U2OS细胞中敲低MAGEA11可抑制细胞增殖、迁移并促进凋亡；而在MG-63细胞中过表达MAGEA11则得到相反的效果，证明MAGEA11能增强骨肉瘤细胞的活力。
3.8. MAGEA11通过维持促胞葬作用轴来协调促肿瘤巨噬细胞表型
机制探索发现，过表达MAGEA11的骨肉瘤细胞条件培养基（CM）能够诱导巨噬细胞向M2表型极化（CD206和IL-10表达升高）。ELISA检测显示，MAGEA11过表达的骨肉瘤细胞及其诱导的巨噬细胞均分泌更高水平的Gas6。更重要的是，这些巨噬细胞中关键的胞葬作用受体MERTK和AXL的mRNA表达也显著上调。这表明MAGEA11通过驱动Gas6的分泌，建立了一个Gas6-MERTK/AXL正反馈回路，从而维持和强化了巨噬细胞的M2极化状态和胞葬作用能力。
3.9. MAGEA11在体内促进骨肉瘤肿瘤生长和巨噬细胞M2分化
小鼠体内实验证实，敲低MAGEA11可显著抑制异种移植瘤的生长，降低肿瘤细胞增殖标志物Ki67的表达。同时，肿瘤组织内的巨噬细胞表现出向M1表型（抗肿瘤）偏移的趋势。这从整体动物水平验证了MAGEA11在促进肿瘤进展和塑造免疫抑制微环境中的关键作用。
综上所述，本研究通过整合多组学数据、机器学习以及深入的功能实验，系统性地揭示了胞葬作用在骨肉瘤预后和免疫微环境塑造中的核心地位。研究不仅构建了一个稳健的六基因预后特征，能够有效预测患者生存和对免疫治疗的潜在反应，更重要的是，发现并实验验证了癌基因MAGEA11通过Gas6-MERTK/AXL轴驱动巨噬细胞M2极化和胞葬作用，从而营造免疫抑制微环境的新机制。这项研究为理解骨肉瘤的恶性进展提供了新的视角，将胞葬作用确立为影响骨肉瘤微环境的关键驱动因素。MAGEA11作为一个癌睾抗原（Cancer-Testis Antigen），因其在正常组织中表达受限，而成为极具潜力的治疗靶点。研究所构建的预后特征和揭示的分子机制，为骨肉瘤的预后分层和开发新的靶向治疗或联合免疫治疗策略奠定了重要的理论基础，具有重要的临床转化意义。
