《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Synergistic effects of glycerol and lactose on propionic acid production by
Cutibacterium acnes ZW-1: Insights from untargeted metabolomics
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Zeyu Wang等利用Cutibacterium acnes ZW-1在90%甘油+10%乳糖共底物体系下发酵生产丙酸，较纯甘油体系增产1.2g/L，最大产率提升至0.80g/L/d。代谢组学分析显示454种差异代谢物，半乳糖代谢和磷酸戊糖途径显著上调，丙酸产量与生物素衍生物、嘧啶核苷酸等正相关。乳糖协同效应通过增强丙酮酸羧化酶和乳酸脱氢酶活性改善氧化还原平衡，为废甘油和乳清废水资源化提供新路径。
王泽宇|徐浩|索敏瑜|梅宇|德米特里·赫林斯潘|萨维茨卡娅·塔齐安娜|克里斯蒂安·肯尼斯|陈俊
浙江省污染暴露与健康干预重点实验室，浙江省新兴污染物全流程监测与绿色治理协同创新中心，浙江树人大学跨学科研究院，杭州310015，中国
摘要
利用乳废液生产生物柴油会产生含有残留乳糖的粗甘油，这些残留物适合作为微生物发酵的共底物。本研究利用Cutibacterium acnes ZW-1将乳糖转化为丙酸（PA），并阐明了少量乳糖如何改变微生物的代谢过程。ZW-1在90%甘油-10%乳糖的共底物培养基和100%甘油对照培养基中分别进行培养。14天后，共底物组的丙酸产量达到4.36克/升，比对照组高出1.20克/升，同时最大生产速率从0.39克/升/天提高到了0.80克/升/天。添加乳糖后，生物量（OD600）从0.62增加到0.74，最终pH值从5.14降至4.68，细胞内NADH/NAD?比率从2.9增加到4.0。丙酮酸羧化酶和乳酸脱氢酶的活性分别提高了1.8倍和2.1倍，表明相关代谢途径得到了增强。非靶向代谢组学分析发现了454种差异代谢物：半乳糖代谢和戊糖磷酸途径显著上调，而生物素衍生物、嘧啶核苷酸、吡啶化合物和脂肪酰基与丙酸产量呈正相关。总体而言，适量的乳糖补充能够促进更高效的甘油发酵，并为将乳制品相关副产物转化为高价值丙酸提供了机制上的支持。
引言
作为一种可再生且环保的能源，生物柴油在全球范围内受到了广泛关注[1]。然而，其生产过程中会产生约10%的粗甘油作为副产物，由于净化和处理成本较高，这对工业界带来了经济和环境方面的挑战[2]、[3]。粗甘油具有较高的还原度（4.7），与丙酸（PA）相似，是Propionibacterium菌株进行厌氧发酵生产PA的理想底物，PA是一种在食品保存、农业和化工领域广泛应用的高价值化学品[4]、[5]。尽管具有这种潜力，但由于代谢限制（如氧化还原失衡和产品抑制）的影响，甘油在丙酸生产中的应用仍受到阻碍，这些因素限制了细菌的生长和酸的产量[6]、[7]。
最近的研究表明，使用复合底物系统可以通过提供额外的碳源和改善代谢平衡来缓解这些限制[8]、[9]。乳废液是一种富含有机化合物（如乳糖）的工业副产物，可作为甘油代谢的可持续共底物[10]、[11]。此外，乳废液还可以作为生物柴油生产的原料，从废水中提取的乳脂油和纯化的脂质可以通过酯交换反应转化为脂肪酸甲酯（生物柴油）[12]、[13]、[14]。此外，由于乳废液中的乳清含有较高浓度的糖分，可用作酵母和微藻等微生物的发酵底物，从而生产单细胞油，进一步增加生物柴油的原料供应[15]、[16]、[17]。将生物柴油和乳废液转化为丙酸不仅有助于资源回收，也符合全球可持续发展目标。
丙酸是一种短链脂肪酸，由于其作为抗菌剂、饲料防腐剂和化工中间体的应用而具有重要的经济价值[18]、[19]。虽然化学合成方法是工业生产的主要方式，但它们依赖于不可再生的石油资源，并且能耗高、污染环境。相比之下，通过厌氧发酵的生物生产方法利用可再生底物，在较温和的条件下实现生产[20]、[21]、[22]。然而，生物生产丙酸的效率仍受底物利用和代谢瓶颈的限制，需要深入理解相关机制以优化产量。Propionibacterium是一种关键的丙酸生产微生物，因为它能够在厌氧条件下通过Wood-Werkman循环代谢多种底物[23]、[24]、[25]。根据环境来源，该菌株可分为两大类：皮肤相关菌株（如Propionibacterium acnes）和经典菌株（如乳制品发酵菌株）[18]、[26]、[27]。尽管关于甘油基发酵的研究较多，但甘油与乳糖结合的协同效应及其相关的代谢调控机制仍需进一步探索。非靶向代谢组学为阐明差异代谢物和代谢途径提供了有力工具，有助于了解共底物如何影响碳流和氧化还原平衡[28]、[29]。
从经济角度来看，丙酸通常被视为大宗商品化学品，其生物生产效果经常与传统的石化路线进行比较[8]、[9]。然而，本研究的动机在于废物和副产物的价值化，而非使用纯化的底物。实际上，生物柴油生产的粗甘油是一种主要的工业副产物，需要耗费大量资源进行净化或处理[2]、[3]；同样，富含乳糖的乳制品副产物和废液也需要有效的处理和资源回收策略[15]、[16]。在这种背景下，关键问题不在于丙酸的市场价格是否高于纯化底物，而在于生物转化是否能够在减轻废物管理负担的同时实现价值回收。因此，本研究并不旨在直接证明其经济竞争力，也不在现阶段进行全面的技术经济评估。相反，丙酸被用作一个有力的平台产品，用于检测细胞内氧化还原平衡和Wood-Werkman循环的调控机制[17]、[18]，从而揭示共底物策略如何缓解甘油基发酵中常见的氧化还原限制[6]、[7]、[19]。这些发现为后续的工艺优化、扩展到其他目标产品以及未来在废物衍生生物精炼框架内的技术经济评估提供了基础。
本研究探讨了甘油和乳糖对Cutibacterium acnes ZW-1生产丙酸的协同效应。ZW-1是一种可追溯的菌株，已存入中国典型培养物保藏中心（CCTCC编号M2024309），这有助于提高研究的可重复性和未来的基准测试。此外，已有报道表明Propionibacterium（Cutibacterium）acnes能够在批次发酵中将甘油转化为丙酸，这进一步证明了该菌株在粗甘油价值化应用中的重要性[28]。通过优化90%甘油和10%乳糖的复合底物系统，我们旨在最大化丙酸产量，并阐明观察到的协同效应的代谢基础。为此，我们测量了关键酶活性、细胞内NADH/NAD?比率，并通过非靶向代谢组学分析共底物供应如何影响丙酸发酵过程中的碳流分布和氧化还原平衡。本研究的新颖之处在于：（i）揭示了少量乳糖如何改变甘油基丙酸发酵过程中的细胞内氧化还原平衡和碳流；（ii）提供了多层次的证据（关键酶活性、NADH/NAD?比率和非靶向代谢组学数据），将底物协同作用与代谢途径重编程联系起来；（iii）为废物转化为化学品的复合底物策略提供了理论依据。
部分摘要
细菌菌株和培养条件
本研究使用的细菌菌株为Cutibacterium acnes ZW-1（也称为Propionibacterium acnes），该菌株是从人体表皮组织中分离得到的[30]。该菌株已存入中国武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），编号为M2024309。培养基的pH值用5摩尔/升的HCl调节至6.5。培养基分装成50毫升的 aliquots，置于带盖的厌氧瓶中。通过……方法去除氧气。
乳糖对丙酸生产的影响
如图1所示，当甘油比例为90%时，丙酸产量最高，达到4.360克/升；其次是85%甘油，产量为3.870克/升；80%甘油的产量为3.840克/升。90%甘油组的最终丙酸产量比100%甘油组高出约1.200克/升，表明在系统中添加10%的乳糖是可行的。关于ZW-1菌株的培养条件以及选择甘油和乳糖的原因……
结论
本研究证明，Cutibacterium acnes ZW-1在90%甘油和10%乳糖的共培养条件下，丙酸产量显著增加，14天后达到4.36克/升，比仅使用甘油的培养系统高出1.20克/升。最大生产速率也提高到0.80克/天。添加乳糖后，细胞生长（OD600）从0.62增加到0.74，氧化还原平衡（NADH/NAD?比率）从2.9增加到4.0。酶活性分析显示丙酮酸羧化酶的活性上调……
CRediT作者贡献声明
索敏瑜：方法学研究。梅宇：数据整理。王泽宇：初稿撰写、实验设计、资金申请。徐浩：概念构思。克里斯蒂安·肯尼斯：指导监督。陈俊：资金申请、项目管理、资源协调、指导监督。德米特里·赫林斯潘：数据可视化。萨维茨卡娅·塔齐安娜：结果验证。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了浙江省自然科学基金（LTGS23D030001）、国家自然科学基金（42207161、42177115）以及国家重点研发计划（2024YFE0108600）的支持。
