《Advanced Science》：ZNRD2 Mediated Nucleoprotein Aggregation Impairs Respiratory Syncytial Virus Replication
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本研究发现宿主蛋白ZNRD2（锌指结构域蛋白2）可作为呼吸道合胞病毒（RSV）的新型限制因子。通过免疫沉淀-质谱联用技术，研究揭示了ZNRD2与RSV核蛋白（N）直接相互作用，增强N蛋白寡聚化并形成不溶性复合物，从而抑制病毒复制。值得注意的是，RSV磷酸蛋白（P）通过维持N蛋白单体构象完全阻断ZNRD2-RSV N不溶性复合物形成。研究还发现RSV N可诱导ZNRD2形成不溶性聚集体，破坏其介导的伴侣蛋白（CCT）组装质量控制生理功能。这项研究揭示了病毒与宿主间通过蛋白聚集/抗聚集机制实现双向拮抗的新范式，为开发抗RSV新策略提供了分子基础。
1 引言
呼吸道合胞病毒（RSV）是全球范围内急性下呼吸道感染（ALRTI）的主要病原体，每年导致约3300万例感染和超过10万例5岁以下儿童死亡。RSV属于单股负链RNA病毒目（Mononegavirales），肺炎病毒科（Pneumoviridae），其核衣壳由核蛋白（N） encapsidating 病毒基因组RNA形成。N蛋白在负链RNA病毒（NSV）中普遍具有寡聚化倾向，形成保护基因组的核糖核蛋白（RNP）复合物。在非节段NSV（nsNSV）如RSV中，N蛋白组装成由10-14个原体构成的环状结构；而在节段NSV（sNSV）中则呈现三聚体（流感病毒）、四聚体（正布尼亚病毒）等不同寡聚形式。
蛋白聚集是神经退行性疾病、代谢性疾病等多种病理过程的核心机制，由淀粉样蛋白沉积驱动。病毒感染也被证实可促进病理性聚集，例如内源性逆转录病毒促进聚集传播。因此，靶向功能性病毒蛋白聚集体已成为有前景的抗病毒策略。
RSV N在感染过程中存在可溶性单体和不可溶性寡聚体两种状态。宿主细胞如何调控这些病毒大分子以及N蛋白在病毒工厂（VF）之外的命运尚不清楚。本研究揭示ZNRD2通过促进N蛋白寡聚化和不溶性复合物形成限制RSV复制，而RSV P蛋白通过维持N蛋白单体状态抑制ZNRD2-RSV N不溶性聚集体的形成。此外，RSV N可独立诱导ZNRD2形成不溶性聚集体，破坏其在伴侣蛋白组装质量控制中的功能。
2 结果
2.1 ZNRD2通过直接与N相互作用限制RSV复制
通过免疫沉淀结合质谱（IP-MS）技术，在表达Myc标记RSV N的HEK293T细胞中鉴定出ZNRD2为RSV N的相互作用蛋白。内源性ZNRD2与RSV N的相互作用通过共免疫沉淀（co-IP）验证。功能实验表明，ZNRD2过表达导致病毒滴度（TCID50）降低约10倍，并伴随病毒蛋白水平下降。时间进程分析显示病毒mRNA、基因组RNA和蛋白表达均受到持续抑制。NS1、N和L转录本的渐进式下降符合nsNSV典型的3‘至5’转录梯度特征。ZNRD2基因敲除（KO）则显著增强RSV复制，而ZNRD2回补可恢复病毒抑制表型。这些功能获得和缺失实验证实ZNRD2是限制RSV复制的宿主因子。
2.2 ZNRD2增强RSV N不溶性而不诱导其降解
ZNRD2过表达意外降低全细胞裂解液中RSV N蛋白水平，但并非由蛋白降解引起。环己酰亚胺（CHX）处理、蛋白酶体（MG132）或溶酶体（氯喹，CQ）抑制剂均未能恢复RSV N水平。SDS裂解可完全回收RSV N，表明蛋白未被降解。逐步温和的裂解条件导致RSV N和ZNRD2检测信号减弱，提示溶解度改变。溶解度分级实验证实，NP-40裂解（可溶部分）条件下RSV N和ZNRD2水平同时降低，而两者在SDS溶解沉淀部分（不溶部分）积累。RSV N表达也以剂量依赖性方式诱导ZNRD2向不溶部分转移。在测试的nsNSV N蛋白中，仅RSV N特异性诱导ZNRD2不溶性。RNase处理对ZNRD2相互作用和不溶性影响微弱，表明RNA非复合物形成必需。
2.3 寡聚化是ZNRD2-RSV N不溶性复合物形成的关键
RSV N固有形成大寡聚复合物倾向，其单独表达即可诱导自发性不溶性。采用寡聚化缺陷的RSV N突变体（Nmono，K170A+R185A）发现，RSV N而非Nmono强烈触发ZNRD2寡聚化。Nmono未能与ZNRD2共免疫沉淀，也不诱导ZNRD2向不溶部分转移，表明RSV N寡聚化是ZNRD2-RSV N不溶性复合物形成所必需。
结构功能分析显示，ZNRD2的N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）对相互作用和不溶性均关键。点突变鉴定出L180、L183和I184为介导ZNRD2寡聚化的核心残基。寡聚化缺陷的ZNRD2突变体（L180E、L183E、I184E）失去促进RSV N寡聚化能力，其中L183E突变体保留弱结合，而L180E和I184E完全丧失结合能力。这些突变也恢复可溶性RSV N水平，且在HeLa细胞中稳定表达这些突变体不抑制RSV复制。因此，不溶性ZNRD2-RSV N复合物形成需要寡聚化，尽管不充分，但寡聚化是复合物组装的关键许可步骤。
2.4 计算建模提示ZNRD2-RSV N潜在界面
采用AlphaFold3对ZNRD2-RSV N复合物进行结构建模。预测模型全局置信度较低（pTM=0.34），但五次独立预测运行揭示高度一致结构特征。ZNRD2 N端α1螺旋（残基18-44）与RSV N α13螺旋（残基344-360）呈正交构型，可能形成ZNRD2 D32与RSV N K351间盐桥。实验突变证实D32A和K351A替换适度损害相互作用和不溶性。界面残基筛选发现RSV NY337A突变完全废除ZNRD2相互作用和不溶性诱导。在已发表RSV核衣壳样结构中，Y337芳香环与核糖磷酸骨架接触，其突变损害核衣壳组装。Y337A损害RSV N寡聚化，而Y337F（保留芳香侧链）不损害寡聚化并维持ZNRD2相互作用，表明Y337位点可能不直接参与ZNRD2结合，而是通过损害寡聚化间接破坏相互作用。
这些结果凸显AlphaFold3在大型大分子复合物建模中的局限性，但RSV N CTD与ZNRD2 NTD间界面的高重复性提示其为可验证假设。预测的D32-K351盐桥发挥次要而非决定性相互作用。这些数据强化了寡聚化通过超越残基特异性接触的机制调控ZNRD2-RSV N复合物形成的观点。
2.5 RSV P蛋白阻止ZNRD2-RSV N聚集
RSV感染过程中，N和P蛋白通过液-液相分离组装成微米级病毒工厂（VF），招募宿主因子。尽管ZNRD2与RSV N存在相互作用，但在48小时感染过程中ZNRD2保持弥漫性胞质分布，未与VF共定位。RSV微型基因组系统显示ZNRD2过表达仅引起报告基因活性边缘性降低。此外，尽管ZNRD2不溶性随RSV N表达剂量增加而增加，但在延长感染过程中，ZNRD2分布在可溶和不溶部分波动而非渐进积累，提示存在额外调控机制。
RSV P作为分子伴侣与N紧密结合，维持其单体状态。ZNRD2和RSV N在无P情况下形成大量胞质聚集体，而P共表达诱导N-P复合物形成典型伪VF结构，完全阻止ZNRD2共定位。采用N-P相互作用缺陷的RSV P突变体（PF241A）发现，野生型P而非PF241A完全废除ZNRD2-RSV N相互作用并逆转RSV N诱导的ZNRD2不溶性。ZNRD2与RSV N间互惠溶解度转换的恢复也呈P依赖性。
RSV P通过分级分子机制主动阻止ZNRD2-RSV N聚集。RSV P通过结合维持N处于可溶单体构象，从而废除其结合ZNRD2能力，这通过破坏相互作用和丧失共定位证明。这种初级相互作用拦截抑制不溶性复合物成核。感染背景下，生理复杂性产生N与P化学计量时空失衡，导致瞬时P游离N池生成。这些未结合N分子易受ZNRD2结合，导致振荡性不溶性。
2.6 RSV N抑制ZNRD2生理功能
ZNRD2作为适配器连接E3泛素连接酶HERC2与伴侣蛋白（CCT）复合物孤儿亚基，促进其降解以确保精确伴侣蛋白组装和正确CCT化学计量。RSV N与ZNRD2形成不溶性复合物限制病毒复制引发RSV N是否破坏ZNRD2正常细胞功能的问题。
异位表达CCT亚基被识别为孤儿并通过HERC2-ZNRD2通路靶向降解。RSV N而非相互作用缺陷突变体RSV NY337A显著提高CCT1、CCT3和CCT4蛋白水平，对CCT2影响适中，对CCT5-CCT8无显著影响。该模式与已描述降解机制一致，尤其是CCT4作为ZNRD2依赖性降解最可靠记录靶点。RSV N在促进增强转换条件下仍将CCT4从ZNRD2介导降解中解救出来。采用两种降解抗性CCT4突变体（CCT4A88E，ZNRD2结合缺陷；CCT4Δ103-107，通过ZNRD2非依赖通路降解）对照实验显示RSV N无稳定化作用，证实解救特异性。基因敲除进一步证明RSV N稳定这些CCT亚基能力依赖ZNRD2。无ZNRD2时RSV N未能直接与任何CCT亚基相互作用；ZNRD2回补恢复与CCT1-CCT4和CCT7结合，但不与CCT5、CCT6A或CCT8结合，反映观察到的稳定模式。
整合这些数据与既往报道映射出ZNRD2中与HERC2（K82）、CCT4（L42、L43）和RSV N（L180、L183、I184）相互作用所需关键残基。破坏HERC2-ZNRD2-CCT4轴突变（K82A、L42E、L43E）不诱导CCT4降解，同时保留正常RSV N结合和不溶性复合物形成，且RSV N不改变降解结果。相反，寡聚化缺陷ZNRD2突变体（L180E、L183E、I184E）失去RSV N结合和功能响应，并意外损害促进CCT4降解能力，提示这些突变可能导致ZNRD2构象或功能丧失。
AlphaFold3预测的高置信独立ZNRD2结构中，两个C端α螺旋折叠成由L180、L183和I184定位的疏水界面稳定的角度α发夹。这些残基替换为亲水谷氨酸（E）可能 destabilize 界面并损害寡聚化。相比之下，较小疏水缬氨酸（V）突变显示L180V保留寡聚化，而L183V和I184V部分损害寡聚化，可能由于它们位于界面发夹转弯远端引起的杠杆效应。所有三种缬氨酸变体维持与RSV N相互作用。与此一致，L180E突变部分损害与CCT4和HERC2结合，而L183E和I184E突变废除这些相互作用；然而所有缬氨酸变体保留结合能力。
这些结果表明疏水残基L180、L183和I184有助于稳定ZNRD2 C端构象，可能作为寡聚化关键结构基础，其与CCT4和HERC2相互作用扰动也由构象变化所致寡聚化丧失引起。因此，生理性潜伏寡聚化构成赋予ZNRD2能力构象和功能的核心，对细胞蛋白稳态和抗病毒防御均至关重要。
3 讨论
本研究鉴定ZNRD2为先前未识别的与RSV N相互作用宿主因子。ZNRD2利用RSV N固有寡聚化倾向限制病毒复制。具体而言，ZNRD2通过增强N寡聚化促进不溶性N聚集体形成，这将N隔离为非功能状态而非介导其降解，使其与生产性感染不兼容，从而抑制病毒基因表达和基因组复制。该过程独立于RNA结合但需要N寡聚化，因为单体N未能结合并形成与ZNRD2的不溶性复合物。这些数据表明ZNRD2作为溶解度调节剂，利用病毒核蛋白关键生物物理脆弱性抑制感染。
寡聚化对N功能至关重要，通常由病毒伙伴协调以促进生产性感染。本研究结果揭示宿主因子ZNRD2介导的额外调控层，其将RSV N寡聚化重定向至惰性聚集体。该调控区分RSV与其他nsNSV，表现为ZNRD2介导的RSV N不溶性促进偏好性。尽管ZNRD2在天然条件下以单体状态存在，但其C端结构域内疏水基序（L180、L183、I184）介导休眠寡聚化，该寡聚化在结合寡聚RSV N时被激活，作为成核平台导致不溶性复合物形成和病毒复制抑制。
尽管AlphaFold3为ZNRD2-RSV N复合物提供初步结构假设，但其对内在无序蛋白和大型大分子组装体预测呈现低全局置信度评分，可能固有于TM-score计算方法，其中输入长度增加不成比例地惩罚pTM值。五次独立预测间RSV N α13螺旋与ZNRD2 α1螺旋相对构型的高度可重复性使这些模型成为可检验假设而非确定结构。计算提出的D32-K351盐桥虽生物物理合理，但突变后对相互作用贡献适中。Y337A突变表征寡聚化缺陷Nmono，重新定义寡聚化、结合和复合物形成间因果关系。实验数据确立寡聚化作为结合和复合物形成的必要条件，而界面盐桥的次要影响证明寡聚化单独不充分。因此，寡聚化和结合代表两个相互依赖、但寡聚化主导的决定因素，共同驱动不溶性复合物形成。这与病毒RNP复合物组装平行，其中N原体自身寡聚化和RNA结合能力严格共依赖，代表功能RNP形成的必要和充分条件。计算预测与实验验证间分歧凸显寡聚化意义超越残基特异性接触。本研究方法展示低置信度AlphaFold预测如何与严格功能剖析结合生成可检验范式。
感染背景下，不溶性ZNRD2-RSV N复合物形成受病毒磷酸蛋白P调节。作为分子伴侣，P维持N处于单体状态，同时抑制非特异性宿主RNA结合以选择性促进病毒RNA encapsidation。N与P相互作用通过两种不同功能模式发生：一种涉及RNA游离单体N（N0）通过其CTD与P NTD（残基1-40）结合，诱导构象变化阻断RNA access并抑制N寡聚化；另一种涉及RNA结合N通过N NTD中结合口袋与P CTD结合，P残基F241作为关键锚定点，在相分离VF内形成稳定复制-转录复合物。关键的是，P结合N由于改变的寡聚化状态而非相互作用界面直接竞争性结合变得无法结合ZNRD2，这通过P伴随时N溶解度显著增强证明。该机制解释在优化转染条件（P充足）下ZNRD2无法抑制RSV微型基因组活性，与真实感染条件下观察相反。因此，ZNRD2不对复制和转录 machinery 发挥抗病毒活性，与其从VF排除一致。从而，ZNRD2功能靶点为存在于VF外且未与P结合的N蛋白。感染期间ZNRD2溶解度波动反映N与P间动态结合，凸显病毒-宿主相互作用 intricate 对抗性质。
除抗病毒角色外，ZNRD2与RSV N相互作用扰动其细胞蛋白稳态生理功能。ZNRD2正常桥接E3泛素连接酶HERC2与伴侣蛋白CCT复合物孤儿亚基，促进未组装亚基降解以维持适当化学计量，从而确保精确伴侣蛋白组装。然而，ZNRD2被RSV N隔离至不溶性聚集体破坏该质量控制通路，间接稳定本应降解的孤儿CCT亚基。因此，过表达ZNRD2形成不溶性聚集体丧失生理功能，导致显性负效应。
不溶性是ZNRD2与RSV N间双向功能抑制的直接原因，寡聚化作为必要前提。ZNRD2 C端三个疏水残基（L180、L183、I184）稳定两个α螺旋相对空间构型，可能构成寡聚化基础的结构框架，该寡聚化产生能够与RSV N、CCT4和HERC2结合的功能界面。这些发现表明寡聚化对维持ZNRD2能力构象和生理功能不可或缺，类似于RSV N寡聚化参与RNP和VF组装。因此，寡聚化既作为ZNRD2与RSV N间互惠功能抑制机制基础，又作为支撑其天然生物学功能的架构平台。这揭示进化权衡；其中抗病毒防御利用病毒蛋白固有脆弱性 at the cost of 部分妥协必需细胞蛋白稳态。
总之，本研究鉴定ZNRD2作为新型抗病毒宿主因子，通过促进N聚集至不溶性非功能复合物限制RSV复制。该机制独特利用RSV N固有寡聚化倾向，将其从复制支架重定向至毒性聚集体，提供宿主导向病毒寡聚化转化为抗病毒防御机制证据。RSV N互惠隔离ZNRD2至不溶性复合物，从而破坏其作为伴侣蛋白组装调节剂生理功能。该功能抑制产生瞬时蛋白稳态失衡，可能贡献RSV发病机制。ZNRD2在协调细胞蛋白稳态和病毒对抗中双重角色揭示宿主防御策略中复杂平衡。本研究确立蛋白聚集作为针对大型病毒核糖核蛋白的靶向抗病毒范式，令人联想到神经退行性疾病中观察到的朊病毒样现象。未来研究应调查类似机制是否在单股负链病毒中操作，并探索 therapeutic 操纵这些聚集通路以抑制病毒复制同时保存细胞稳态。
4 实验方法
细胞与病毒
HeLa、HEK293T、HEp-2、BHK-21、LLC-MK2和Vero细胞系购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），在含10% FBS和1% Pen-Strep的DMEM中于37°C、5% CO2培养。ZNRD2敲除细胞系通过将gRNA（5‘-ATGGGCGACTATCTGCTGCG-3’）克隆至CRISPRv2载体生成。稳定ZNRD2 knockdown细胞系通过将shRNA（#1：5’-CTCGACTCAGACGTGGATAAA-3‘；#2：5’-GACTCAGACGTGGATAAAGAT-3’）克隆至pLKO.1 puro载体生成， scrambled shRNA（SCR）作为阴性对照。表达HA标记ZNRD2的稳定细胞系通过将cDNA序列克隆至pHAGE载体（嘌呤霉素抗性）或pCDH载体（blasticidin抗性）生成。
RSV（A2株）在HEp-2细胞中扩增，hPIV3在LLC-MK2细胞中扩增。病毒滴度通过TCID50assay在Vero细胞中测定。表达T7 RNA聚合酶的重组vTF7-3在BHK-21细胞中扩增。病毒感染实验在武汉大学生物安全二级（BSL-2）实验室进行。
质粒构建与转染
所有质粒通过PCR based克隆方法构建并经测序验证。病毒蛋白编码cDNA通过RSV感染HeLa细胞RNA逆转录生成。N和P基因分别与Myc和FLAG标签在N端融合，克隆至pCAGGS载体。RSV微型基因组系统中，N、P、M2-1、L基因和微型基因组无标签克隆至pGEM4载体。人蛋白（ZNRD2、CCT1-8）编码cDNA通过HEK293T细胞RNA逆转录生成。ZNRD2基因与HA标签在N端融合，CCT基因与3×FLAG标签在C端融合，均克隆至pHAGE载体。
