《Advanced Science》：Platelet Rubicon Bidirectional Regulation of GPVI and Integrin αIIbβ3 Signaling Mitigates Stroke Infarction Without Compromising Hemostasis
血小板Rubicon双向调控GPVI与整合素αIIbβ3信号通路减轻脑卒中梗死而不影响止血功能
摘要
抑制血小板糖蛋白VI是减少脑缺血再灌注损伤且不严重损害止血功能的有前景策略，而靶向糖蛋白IIb/IIIa则会导致出血。本研究显示，巨核细胞-血小板特异性缺失自噬蛋白Rubicon会加速卒中发展并加重脑出血。Rubicon与Bruton酪氨酸激酶相互作用抑制GPVI介导的血栓形成，同时阻止αIIbβ3介导的选择性自噬和Btk降解以稳定血小板血栓。急性缺血再灌注损伤患者血小板中Rubicon表达降低。模拟Rubicon-Btk相互作用的细胞穿透肽在小鼠模型中显著减小脑梗死体积。由于Rubicon对止血非必需但对CIRI的再灌注阶段至关重要，模拟其效应的肽可能提供一种选择性且安全的治疗策略。
1 引言
血小板是止血的基石，也是病理性血栓形成的主要元凶。现有抗血小板治疗始终面临出血风险，典型代表是脑缺血再灌注损伤；患者抗血小板治疗后可能恶化为脑出血。因此，严格研究血小板活化机制以区分其生理和病理作用至关重要。近期研究揭示，病理性血栓形成可通过血小板特异性受体与止血区分。阻断胶原主要受体GPVI可在脑中动脉闭塞模型中保护动物免受CIRI损伤。相反，阻断负责血小板同型聚集的关键黏附分子整合素αIIbβ3对卒中面积无影响，反而增加同一模型中脑出血发生率和死亡率。GPVI负责血栓形成的快速启动，而αIIbβ3则在血小板间形成桥梁并维持血栓稳定性。尽管GPVI和αIIbβ3均 crucial 参与血栓形成，但靶向这两个受体导致CIRI和脑出血的矛盾结果仍缺乏合理解释。
自噬是进化保守的分解代谢途径。血小板自噬被提示为缺血再灌注损伤的重要参与者。缺乏关键自噬调节因子的小鼠实验证实自噬蛋白在血小板活化中的功能重要性。值得注意的是，VPS34促进GPVI介导的血小板活化，却不参与或负调控αIIbβ3通路。这些观察表明，自噬蛋白，尤其是VPS34相关蛋白，可能掌握着在缺血再灌注损伤背景下差异调控GPVI和αIIbβ3信号的关键机制。
Rubicon是一种胞质蛋白，以负调控VPS34复合物和自噬而闻名，并在多种组织缺血再灌注损伤中显示为重要调节因子。例如，心肌细胞表达的Rubicon加剧心肌梗死小鼠模型的缺血再灌注损伤。内皮细胞表达的Rubicon降低内皮细胞活力并在tMCAO模型中导致血脑屏障破坏。此外，尽管自噬调控是Rubicon最广泛报道的机制，但它也具备自噬非依赖性机制。鉴于理解血小板受体在CIRI中差异调控的迫切性，Rubicon成为重要候选分子。
2 结果
2.1 巨核细胞/血小板特异性Rubicon缺失导致矛盾的止血表型
Rubicon在人和小鼠血小板以及巨核细胞系MEG-01中均有表达。构建巨核细胞/血小板特异性Rubicon缺陷小鼠，这些小鼠表现正常存活率和生育能力，无自发性出血或血栓事件。基本血液学参数与野生型相当，仅平均血小板体积略有增加。
Rubicon缺失不改变III类PI3K复合体组分表达或血小板表面糖蛋白。超微结构分析显示血小板形态正常。血清素含量也相当。Rubicon?/?巨核细胞表现正常倍体水平、大小和核大小。这些结果表明Rubicon对正常血小板发育和颗粒形成非必需。
尽管血小板发育正常，Rubicon缺失导致止血和血栓形成 contrasting 效应。在断尾实验中，突变小鼠出血时间显著缩短，近半数出血时间低于1分钟，而野生型仅17%。突变小鼠再出血发生率略高。矛盾的是，在FeCl3诱导的肠系膜小动脉损伤模型中，Rubicon缺陷小鼠稳定闭塞时间延长，脱落的栓子增加近三倍，提示血栓稳定性受损。
这种矛盾在不同剪切条件下全血灌注实验中得到进一步探索。在低剪切下，Rubicon缺陷血小板在胶原表面形成更大血栓，而在高剪切下，它们初始形成正常血栓但随后变得高度不稳定。这些发现表明，Rubicon在低剪切下限制初始血栓形成，但在高剪切下对维持血栓稳定性至关重要，提示其对不同血小板活化通路的差异调控。
2.2 Rubicon差异调控GPVI和整合素αIIbβ3信号通路
为阐明观察到的止血表型的分子基础，检测了血小板对不同激动剂的聚集和信号响应。Rubicon缺陷血小板对低浓度胶原的反应显示显著增强的聚集和致密颗粒分泌，但对较高浓度无变化。相反，对凝血酶、ADP或U46619的反应未改变，表明通路特异性效应。且胶原刺激诱导的TXB2水平和VASP磷酸化在突变血小板中与野生型相似。用apyrase或阿司匹林预处理不废除增强的胶原反应，提示对GPVI通路的直接效应而非通过致密颗粒分泌或血栓烷A2的次级放大。
生化分析显示胶原刺激后Rubicon缺陷血小板中Btk和PLCγ2磷酸化增强，而早期信号分子磷酸化不变。时间过程分析证实整个聚集响应中PLCγ2磷酸化的持续增强，确认GPVI通路过度活化。与对GPVI信号的抑制效应形成鲜明对比，Rubicon正调控整合素αIIbβ3由外向内信号。Rubicon缺陷血小板在固定纤维蛋白原上的铺展面积显著减少，添加外源性ADP可 normalize。同样依赖αIIbβ3由外向内信号的 clot 收缩在Rubicon缺陷血小板中显著延迟。生化分析显示纤维蛋白原铺展过程中β3、AKT、PLCγ2和ERK磷酸化减少，确认受损的αIIbβ3由外向内信号。这些发现确立Rubicon作为双向调节器，抑制GPVI介导的活化而促进αIIbβ3介导的由外向内信号，解释体内观察到的矛盾止血表型。
2.3 Rubicon双调控功能的分子机制
为阐明Rubicon双调控功能的分子机制，进行了免疫沉淀结合质谱分析静息和胶原刺激血小板中Rubicon相互作用蛋白。基因本体和KEGG通路分析显示，在静息血小板中，Rubicon主要与自噬相关蛋白结合，而在胶原刺激血小板中，它与细胞分化、胞内蛋白转运和信号转导相关蛋白相互作用。
在静息血小板中，Rubicon与VPS34、VPS15和Beclin-1共沉淀，符合其作为III类PI3K复合物负调控因子的既定角色。胶原刺激后，Rubicon从这些蛋白解离并与Btk相互作用。Rubicon缺失增加静息和刺激血小板中PI(3)P产生，确认其对VPS34活性的抑制效应。与先前研究一致，Rubicon缺失也增强GPVI刺激后phoxp40磷酸化和ROS生成，但清除ROS不废除增强的聚集，提示Rubicon缺失导致的ROS增加不是GPVI信号增强的主要机制。
Btk在介导Rubicon对GPVI信号抑制效应中的关键作用通过添加Btk抑制剂Acalabrutinib证实，该抑制剂消除野生型和Rubicon缺陷血小板间的聚集差异。为鉴定Rubicon的Btk结合域，生成各种Rubicon多肽片段。免疫沉淀显示RUN结构域是Btk相互作用所必需且 sufficient。GST pull-down实验进一步确认RUN域与Btk的相互作用。进一步 mapping 鉴定Btk的N端区域为与Rubicon的结合界面。
为研究Rubicon在αIIbβ3由外向内信号中正调控的机制，检测了血小板在纤维蛋白原上铺展时的自噬。Rubicon?/?血小板形成较少LC3阳性点状结构和降低的LC3-II形成。用NH4Cl处理废除这些差异并 normalize Rubicon缺陷血小板的铺展面积。此外，bafilomycin A1恢复Rubicon?/?血小板LC3-II形成至野生型水平。这些数据表明Rubicon通过抑制自噬促进由外向内信号。
为阐明Rubicon在自噬中的功能阶段，进行了血小板在纤维蛋白原上铺展时的LC3 II免疫荧光和LysoSensor染色。结果显示Rubicon缺失减少LC3 II+点状结构数量，增加LAMP2+LC3 II+点状结构数量。LysoSensor Green DND-189染色评估溶酶体酸化，Rubicon?/?和野生型血小板间观察到可比荧光强度，表明Rubicon缺失不影响溶酶体酸度。因此，Rubicon缺失可能主要通过增强自噬体-溶酶体融合影响血小板自噬流。
随后检测选择性自噬降解信号分子是否解释受损的由外向内信号。由于选择性自噬降解的蛋白被泛素标记，通过4D质谱分析了用Mn2+刺激血小板诱导整合素由外向内信号时的蛋白泛素化。分析显示Btk在Lys12被泛素化，Rubicon缺陷血小板中泛素化水平更高。在纤维蛋白原铺展过程中，Rubicon缺陷血小板显示增加的Btk-p62-LC3II相互作用和更强的Btk-p62共定位。重要的是，铺展60分钟后Rubicon缺陷血小板Btk蛋白水平显著降低。这种减少被NH4Cl和Bafilomycin A1阻止，但不受MG-132影响，提示自噬而非蛋白酶体降解负责。此外，Btk抑制剂ACP-196处理减少铺展面积并消除野生型和Rubicon?/?血小板间差异。
这些数据确立Rubicon通过两种 distinct 机制双向调控血小板功能：在GPVI通路中通过RUN域相互作用直接抑制Btk；在防止选择性自噬降解Btk以促进αIIbβ3由外向内信号。
2.4 血小板Rubicon保护 against 脑缺血再灌注损伤和出血转化
鉴于Rubicon在GPVI和αIIbβ3通路中的双调控作用以及这两个通路在促进脑梗死和防止脑出血中的关键作用，研究了其在短暂脑中动脉闭塞模型中的病理生理意义。在突变小鼠中，脑梗死体积比对照增加超过32%，死亡率显著更高。有趣的是，与体外发现一致，经历tMCAO的突变小鼠血小板总Btk水平显著降低，而磷酸化Btk/总Btk比率增加。显著地，脑出血在Rubicon缺陷小鼠中显著增加，伴随显著更差的神经功能和运动性能。重要的是，在无再灌注的永久MCAO模型中，基因型间梗死体积无差异，表明Rubicon的保护效应特异于缺血损伤的再灌注阶段。
随后研究了Rubicon在再灌注触发的次级损伤过程中的作用。除发现Rubicon?/?血小板在CRP刺激后产生显著更高水平ROS外，流式细胞术分析显示Rubicon?/?血小板在CRP刺激后细胞内Ca2+动员显著增强。Evans blue外渗实验证明突变小鼠tMCAO后血脑屏障通透性显著更大。tMCAO后24小时脑组织分析显示突变小鼠IL-6水平显著升高。这些结果 collectively 表明血小板Rubicon缺失导致氧化应激、钙失调、神经炎症和血脑屏障破坏，从而加剧再灌注损伤。
血小板Rubicon表达分析显示tMCAO后24小时与假手术或pMCAO模型相比显著下调。这一发现在人类样本中得到证实。卒中患者 undergoing 血栓切除术的血小板Rubicon表达显著降低。体外，血小板中Rubicon表达在胶原刺激后呈浓度和时间依赖性降低，这种降解被蛋白酶体抑制剂MG132阻止。这些结果表明Rubicon下调与血小板活化和缺血再灌注过程 intrinsically 关联。
2.5 细胞穿透性Rubicon肽在tMCAO模型中减少卒中损伤
基于Rubicon表达在缺血再灌注期间降低且Rubicon缺失加剧卒中结局的发现，假设补充Rubicon功能可能减轻卒中损伤。首先进行基于知识的蛋白质-蛋白质对接以识别Rubicon的RUN域与Btk的PH域间推定结合模式。预测Rubicon-Btk复合物的3D结构，根据Hawkdock评分和MM-GBSA算法计算自由结合能。关键残基用于蛋白质-蛋白质相互作用提供。
设计包含关键结合残基的Rubicon肽和相应丙氨酸替代突变肽。添加七精氨酸标签至肽C端用于高效细胞递送。免疫荧光确认细胞摄取。
这些肽中，WT1肽有效破坏转染HEK293T细胞中Rubicon-Btk结合，并显著降低野生型血小板中胶原诱导的血小板聚集和ATP释放，消除野生型和Rubicon?/?血小板间差异。生化上，该肽降低PLCγ2和Btk磷酸化，确认其对GPVI信号的抑制效应。
为评估治疗潜力，在tMCAO前给小鼠注射Rubicon肽。再灌注24小时后，用WT1肽处理的小鼠梗死体积显著减少，而DMSO或其他肽无此效应。显著地，该肽即使在 occlusion 开始后85分钟给药仍保留疗效，表明 substantial 治疗窗口可能具临床相关性。
这些结果表明模拟Rubicon与Btk调控相互作用的肽有效减少卒中模型中的缺血损伤，为靶向血小板特异性机制 underlying 脑缺血再灌注损伤的新治疗策略提供概念验证。
3 讨论
本研究首次证明Rubicon通过差异调控血小板GPVI和整合素αIIbβ3信号通路在脑缺血再灌注损伤中作为关键保护因子。通过其与Btk的相互作用，Rubicon抑制GPVI介导的由内向外信号以防止过度血小板活化和减少梗死，同时抑制自噬降解Btk，从而促进整合素αIIbβ3介导的由外向内信号以增强血栓稳定性和防止出血。这种双调控机制为先前观察到的GPVI与αIIbβ3抑制在卒中模型中矛盾效应提供分子解释，并为治疗干预开辟新途径。
使用巨核细胞/血小板特异性Rubicon缺陷小鼠，证明Rubicon缺失显著增加缺血再灌注损伤期间脑梗死体积和继发出血。这种表型直接对应Rubicon在血小板信号中的功能：特异性抑制GPVI通路和增强整合素αIIbβ3由外向内信号。先前研究 established GPVI在促进脑梗死中的作用和αIIbβ3在防止继发出血中的需求；我们的发现现在表明这些看似不同的功能通过Rubicon调控 intrinsically 统一。
在分子水平，发现Rubicon在静息血小板中组成性结合VPS34复合物但在GPVI活化后解离。尽管这种相互作用符合Rubicon作为VPS34负调控因子的既定角色，但我们的发现揭示更复杂图像。Rubicon调控的血小板活化在几个重要方面不同于VPS34介导的效应：Rubicon选择性调控GPVI介导而非GPCR介导的活化，且尽管Rubicon影响PI(3)P产生和ROS生成，消除ROS不废除Rubicon缺陷和野生型血小板间胶原诱导聚集的差异。这些观察表明Rubicon通过超越VPS34-ROS生成的机制调控GPVI信号。
Btk作为Rubicon相互作用伙伴的鉴定为其对GPVI信号效应提供机制解释。与先前报道PH域在膜靶向和Btk激酶活性中的重要性一致，我们的数据证明Rubicon的RUN域与Btk的PH域间相互作用对Rubicon抑制功能 crucial。我们的结果提示一个模型，其中Rubicon在GPVI活化后动态切换其结合伙伴从VPS34到Btk。重要的是，这种Btk抑制似乎特异于GPVI通路，因为凝血酶刺激未观察到相互作用或功能差异。尽管缺乏对Rubicon衍生肽在CIRI出血转化中的单独评估，我们的发现证明其在血小板活化中的双向精细调控效应。这表明靶向Rubicon可能提供优于全球Btk抑制剂的安全策略。
我们的研究也为自噬如何整合血小板活化提供新见解。证明选择性自噬特异性嵌入血小板整合素αIIbβ3由外向内信号，且Rubicon抑制这一过程。我们的结果扩展先前观察即整合素活化可诱导自噬，并鉴定Btk作为αIIbβ3诱导自噬选择性降解的货物。通过抑制Btk的自噬降解，Rubicon促进αIIbβ3由外向内信号和血栓稳定性。这确立一个统一机制，其中Rubicon通过 distinct 靶向同一分子Btk差异调控GPVI和αIIbβ3通路。
胶原刺激或缺血再灌注后Rubicon表达的下调进一步突出其作为血小板活化刹车的重要性。这种表达减少不仅确认Rubicon作为GPVI介导活化抑制因子的角色，也为旨在恢复Rubicon功能的治疗策略提供理论依据。模拟Rubicon-Btk相互作用的肽在体外有效减少血小板聚集并在tMCAO小鼠模型中减小梗死体积，证明该策略的概念验证。一个特别有前景的发现是我们的Rubicon衍生肽在缺血后但再灌注前给药的有效性。这种至少 occlusion 后85分钟的治疗窗口区分我们的方法与纯粹预防性策略，并增强其潜在临床相关性。
本研究有几个局限性。尽管Rubicon相互作用伙伴切换和后续功能 clearly GPVI依赖，但GPVI活化如何导致这些改变不清楚。此外，尽管我们聚焦Rubicon的RUN域，其他域的潜在角色未彻底研究。而且，本研究患者队列规模相对较小。
总之，我们的研究提供 compelling 证据表明血小板Rubicon通过自噬和非自噬机制在CIRI中起保护作用，这些机制差异调控关键信号分子Btk。由于Rubicon降解与血小板活化 intrinsically 关联，恢复其分子功能代表一个有前景的治疗策略，通过同时解决过度血栓形成和出血转化风险来减轻卒中进展。
