《Advanced Science》：TOGR3, a Proteasome β4 Subunit, Orchestrates Sugar Homeostasis to Trade Off Growth and Thermotolerance in Rice
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本研究揭示了水稻26S蛋白酶体β4亚基TOGR3通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）调控糖代谢稳态的新机制。该研究发现TOGR3依赖的UPS选择性降解糖代谢酶，促进叶片糖分积累，从而协同调控气孔动态和碳源供应，实现生长与耐热性的最佳平衡。值得注意的是，TOGR3与α2亚基TT1的协同过表达可进一步增强水稻耐热性，为作物抗逆育种提供了新靶点。
TOGR3的发现与表型特征
通过EMS诱变水稻品种中花11号，研究者获得了一个隐性突变体togr3，该突变体表现出温度依赖的生长缺陷。在适度温度条件下，togr3植株呈现多效性发育异常，包括矮化、分蘖过多、叶片窄卷、结实率和百粒重降低等特征。值得注意的是，这些表型表现出明显的环境可塑性——在冬季海南和夏季北京的不同田间条件下，突变体的表型严重程度存在显著差异。
控制环境实验表明，野生型中花11号植株表现出典型的热形态建成反应，即在温度升高至热应激阈值前，茎秆逐渐伸长。而togr3突变体则呈现温度依赖的生长抑制：在25°C~26°C下保持接近正常株高，但在28°C~35°C下出现严重矮化。这种反应具有累积效应，长时间热暴露会进一步加剧表型严重程度。解剖学分析显示，togr3突变体的前四个节间成比例缩短，第五个节间完全抑制，这是由于细胞伸长和增殖减少所致。
红外热成像显示，togr3植株在所有测试条件下叶片温度持续高于野生型，表明其热调节能力受损。急性热应激实验进一步证明，togr3幼苗的耐热性显著降低，表现为热处理期间快速失水和存活率显著下降。这些结果共同表明togr3突变同时损害了热适应性生长和耐热性这两个植物热适应的核心组成部分。
TOGR3编码26S蛋白酶体的唯一β4亚基
通过图位克隆，研究者将突变定位到3号染色体上一个455-kb的区间内。全基因组重测序发现，LOC_Os03g48930基因第二个外显子中的T-to-C替换导致β4亚基高度保守的N端结构域发生Leu66Pro氨基酸改变。系统发育分析显示，蛋白酶体β4亚基在真核生物中高度保守，在植物到哺乳动物中均以单拷贝直系同源物形式存在，且Leu66残基完全保守。
遗传互补实验证实，将包含天然启动子、完整编码区和3'非翻译区的5.5-kb基因组片段导入togr3植株，可完全挽救所有突变表型。此外，组成型过表达也恢复了突变体的正常生长，而RNA干扰介导的敲低则重现了togr3的温度依赖性矮化表型。
研究表明，野生型TOGR3的转录和蛋白水平在高温下上调，而突变体togr3的表达显著降低。蛋白酶体活性分析显示，togr3突变体呈现温度依赖的酶活性改变：胰凝乳蛋白酶样活性在25°C降低，在35°C先短暂抑制后增强；胰蛋白酶样活性在两个温度下均持续升高；而 caspase样活性严重受损，尤其在35°C下。这些酶缺陷与其热敏感生长表型相关，并与高温条件下泛素化蛋白的显著积累相一致。
TOGR3通过气孔动态介导热调节功能
红外热成像揭示了基因型间在从25°C向35°C转变过程中不同的叶片温度动力学。野生型植株叶片温度初始为21.5°C，在第一分钟内出现显著波动，峰值达27.7°C后逐渐稳定。而togr3突变体初始温度更高，波动幅度更大，峰值温度达29.7°C。相反，TOGR3过表达株系表现出增强的热缓冲能力，尽管初始温度略高于野生型，但第一分钟波动幅度更小，峰值温度更低。
冷冻扫描电镜分析揭示了TOGR3介导叶片热调节的细胞基础。在恒定25°C下，野生型、togr3和TOGR3过表达株系的气孔开度相当。然而，在25°C向35°C的温度转变过程中，togr3突变体气孔开度显著大于野生型，并在持续高温下保持这种开放状态。相比之下，TOGR3过表达株系在温度升高后表现出加速的气孔关闭。这种快速的气孔响应可能通过限制热空气流入来发挥热调节机制作用，有助于维持叶片温度稳态。
此外，TOGR3过表达在长期高温条件下增加了气孔密度，而对其他气孔形态特征影响最小。这些发现表明，TOGR3协调调控气孔开度动态和气孔发育，以优化高温条件下的叶片冷却能力。
TOGR3平衡热耐旱性与生长
耐热性实验表明，TOGR3 RNAi植株的耐热性严重受损，与togr3突变体相当，而过表达株系则表现出显著增强的热抵抗能力。分子表征显示，与野生型相比，togr3突变体在热应激下泛素化蛋白加速积累，表明蛋白质稳态破坏是热敏感表型的基础。
对热应激togr3突变体的初步观察显示明显的叶片卷曲、快速脱水和气孔调节受损，表明TOGR3可能在干旱响应中发挥作用。在控制高温低湿条件下的生长分析显示，togr3幼苗出现加剧的生长缺陷。耐旱性实验进一步证明，togr3和RNAi株系的存活率显著降低，而过表达植株在复水后保持优越的保水和恢复能力。
为评估TOGR3增强的耐逆性可能伴随的生长权衡，研究者分析了在多个种植季节自然田间条件下以及控制温室环境热应激下野生型中花11、togr3和两个TOGR3过表达株系的农艺性状。与野生型相比，togr3突变体表现出严重的发育缺陷，而过表达对整体植株结构或结实率没有显著影响。值得注意的是，两个过表达株系在田间条件和热应激下均表现出增大的籽粒大小和百粒重。此外，TOGR3过表达植株在多个生长季节持续生产低垩白度的高品质籽粒。
TOGR3通过泛素-蛋白酶体系统介导热响应泛素化组
为阐明TOGR3在热适应过程中如何调节泛素-蛋白酶体系统，研究者对在适度温度和高温条件下生长的野生型和togr3幼苗进行了比较泛素化组学分析。整合蛋白质组-泛素化组分析通过将泛素化肽段标准化为总蛋白丰度，实现了泛素化水平的化学计量定量。
togr3突变体在两个温度下均表现出多聚泛素化底物的显著积累。高温下增加的泛素化负担与表型严重程度相关，并与UPS损伤的western blot证据一致。功能富集分析揭示了两个主要功能类别：UPS自调节和碳水化合物生物合成与代谢。这一趋同表明TOGR3将UPS活性导向热敏感调控通路内的特定节点蛋白。
与已发表的急性热应激泛素化组数据集的交叉比较发现，在慢性升温和急性热条件下，与碳水化合物代谢、UPS功能和应激响应相关的泛素化蛋白存在趋同。值得注意的是，参与碳水化合物代谢的多种酶在togr3中表现出泛素化升高，尤其是在高温条件下，同时伴随蛋白丰度和酶活性增加。
TOGR3依赖的UPS通过调节糖稳态促进耐热性
泛素化组分析显示，TOGR3依赖的UPS活性优先靶向碳水化合物动态，将糖稳态定位为核心下游输出。直接评估糖动态的实验表明，togr3突变体在所有测试条件下均表现出显著降低的蔗糖、葡萄糖和总可溶性糖水平。温度升高后，野生型植株快速积累叶片糖分，而togr3反应迟钝，导致热应激期间差异逐渐扩大。
糖积累与气孔调节紧密相关，保卫细胞中糖水平升高促进气孔关闭，而低水平利于开放。与此一致，TOGR3增强的糖积累与改善的气孔响应性和优越的叶片热调节能力相关，支持糖稳态通过气孔动态在耐热性中的功能作用。
外源糖补充进一步证实了这一关系。蔗糖处理引发剂量依赖效应：野生型植株随蔗糖浓度增加呈现渐进生长抑制，而togr3突变体在0.005%蔗糖下部分表型挽救，且对更高浓度敏感性降低。在细胞水平，0.005%蔗糖处理部分抑制了热应激togr3植株的过度气孔开放。最显著的是，蔗糖预处理完全挽救了togr3突变体的受损耐热性，并进一步增强了野生型植株的热抵抗能力。
TOGR3调节26S蛋白酶体复合物的回收
泛素化组分析显示，在测试的两个温度下，togr3突变体中大多数26S蛋白酶体核心颗粒亚基的泛素化显著升高。这种效应在高温下显著增强，表明TOGR3是热适应过程中泛素化核心亚基正确自调节周转所必需的。
为评估这种增加的泛素化是否影响亚基丰度，研究者分析了全局蛋白质组数据。大多数核心颗粒亚基在togr3中蛋白水平显著降低，与过度UPS介导的降解一致。这些结果表明紧密控制的蛋白酶体亚基周转对于维持最佳复合物完整性至关重要，尤其是在环境应激下。
值得注意的是，TOGR3作为水稻中唯一的β4亚基，尽管蛋白丰度高，但在野生型或togr3植株中均未检测到泛素化肽段。这种泛素化缺失表明TOGR3作为26S蛋白酶体不可或缺且非冗余的调控组分，在耐热性过程中发挥蛋白酶体回收和自调节的核心作用。
TT1和TOGR3协同调控水稻耐热性
TT1作为26S蛋白酶体的α2亚基，对水稻耐热性至关重要。蛋白质组分析显示，与TOGR3类似，TT1未检测到泛素化，同时表达模式相似。尽管TT1和TOGR3在蛋白酶体复合物内不直接相互作用，但基因本体分析发现这两个亚基间存在显著功能重叠，表明在热适应中可能存在协同作用。
为验证这一假设，研究者在野生型和togr3背景中生成TT1过表达株系。TT1过表达部分挽救了togr3的矮化，并在高温下增强了野生型的株高。与先前报道一致，TT1过表达显著提高了野生型背景下的热应激存活率，并显著恢复了togr3突变体的受损耐热性。
为确定TT1和TOGR3是否共享保守的热调节机制，研究者监测了中花11、togr3以及中花11和togr3背景中TT1过表达株系在温度转变过程中的叶片温度动态。TT1过表达植株在热刺激第一分钟内表现出优越的热缓冲能力。冷冻扫描电镜进一步显示，TT1过表达加速了温度升高后的气孔关闭，模拟了TOGR3介导的气孔动态调节。
为评估这两个亚基的联合效应，研究者通过遗传杂交生成TOGR3-TT1共过表达株系。与TOGR3单过表达相比，共过表达植株表现出增加的气孔密度、增强的气孔开度动态和升高的细胞糖水平。热应激实验表明，共过表达幼苗比单亚基过表达株系表现出更强的耐热性。农艺分析显示，TOGR3-TT1共过表达植株保持与单亚基过表达株系相当的植株结构和籽粒质量。
讨论与展望
本研究揭示了水稻中一个先前未被认识的热调节机制。在适度条件下，TOGR3与其他26S蛋白酶体亚基组装形成功能性泛素-蛋白酶体系统，介导热响应泛素化。这一过程促进糖生物合成和代谢中错误折叠蛋白的回收，从而维持叶片糖稳态，满足碳源利用以及气孔动态调节的需求。这些协调效应增强叶片冷却并支持植物生长。
研究者提出，TOGR3介导的UPS代表了一种潜在通用的植物非生物逆境抗性机制。与经典研究认为植物对热和干旱的响应由 largely 拮抗的调控机制控制不同，本研究证明TOGR3介导的UPS同时增强耐热性和抗旱性，表明该模块作为共享且整合的逆境抗性机制发挥作用。
值得注意的是，TOGR3依赖的UPS活性还通过加速26S蛋白酶体亚基在应激下的周转而增强蛋白酶体回收。在20S核心颗粒亚基中，TOGR3和TT1在水稻中独特地缺乏可检测的泛素化。这种独特特性可能与β4亚基的结构特征有关，值得进一步生化
