《Advanced Science》：A Modular DNAzyme for Precise Visualization and Intervention of Alternative Splicing Isoforms in Live Cells
1 引言
可变mRNA剪接（alternative mRNA splicing）是真核生物基因表达调控的关键机制，通过选择性包含或排除特定外显子产生多种转录亚型。这一精细调控机制极大扩展了真核生物的功能和蛋白质组多样性，在组织特异性基因表达、发育调控和环境适应中发挥重要作用。剪接失调已成为多种疾病的致病驱动因素，包括癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和免疫功能障碍。虽然新一代测序和转录组学技术加深了我们对群体水平剪接景观的理解，但对单个活细胞内剪接事件的时空动力学仍知之甚少。
目前大多数剪接分析技术依赖于固定细胞方法，限制了其捕捉剪接调控动态特性的能力。单分子荧光原位杂交（smFISH）虽能实现亚细胞分辨率下的mRNA亚型可视化，但需要复杂探针设计和化学固定，无法观察活细胞中的瞬时或实时剪接动力学。其他策略如基于padlock探针的SpliceRCA虽提高了灵敏度，但依赖酶递送且仅限于固定细胞系统。
活细胞兼容系统的开发面临诸多挑战。等离子体原位二聚化方法易受纳米颗粒聚集影响，而还原触发荧光（RETF）策略在复杂细胞内环境中信噪比低。这些方法的共同局限是对邻近激活的依赖性，增加了非特异性相互作用和假阳性信号的风险。
脱氧核酶（DNAzyme）作为合成单链DNA催化剂，能够执行靶标特异性切割或化学修饰反应。其可编程结构、强大催化活性和自主信号放大能力使其特别适合活细胞应用。与邻近激活系统不同，DNAzyme可被设计为在精确触发前保持催化惰性，从而提供对信号激活的改进控制并最小化非特异性干扰。特别是工程化的8-17家族DNAzyme在体内保持靶标响应活性和稳定性，已在小动物成像、肿瘤模型和临床评估中展示出转化潜力。
2 结果与讨论
2.1 SUPER系统用于Bcl-x变异体识别的设计与机制
B细胞淋巴瘤-x（Bcl-x）基因通过可变剪接产生两种功能不同的亚型：抗凋亡的Bcl-xL（长亚型）和促凋亡的Bcl-xS（短亚型）。这两种亚型之间的平衡对维持细胞稳态至关重要，其中Bcl-xL/Bcl-xS比率升高与癌症转移和化疗耐药密切相关。
SUPER系统采用RNA切割型8-17 DNAzyme，按照经典的多组分核酸酶（MNAzyme）策略在其催化核心进行分裂。分裂后的两个传感器臂分别接枝到部分酶上，确保高靶标特异性。为增强检测稳健性和灵敏度，通过生物素-链霉亲和素介导的缀合对裸部分酶进行工程化改造，锚定不同荧光团/淬灭剂对标记的底物，从而产生三底物缀合的部分酶探针（3S0-P0和3S1-P1）。
当识别Bcl-xL mRNA时，3S0-P0和3S1-P1探针被招募并重新折叠成天然DNAzyme构象，启动双侧底物的局部化连续切割，产生局部化双色荧光读出信号。Bcl-xL和Bcl-xS亚型共享相同的第2外显子序列，因此3S0-P0作为共同参考探针，而3S1-P1和3S2-P2分别特异性识别Bcl-xL和Bcl-xS。
这种原位自限制、双激活DNAzyme生物催化作为严格的分子识别到信号转导"双重检查"机制，确保只有真实的剪接亚型才能产生真正的读出信号。通过结合高分辨率生物分子识别和误差鲁棒的DNAzyme催化，这种双色成像策略能够以低模糊度同时可视化特定mRNA亚型。
2.2 SUPER介导的Bcl-xL和Bcl-xS mRNA体外响应传感
通过系统优化部分酶系统的催化效率，发现没有延伸序列的P0和P1组合表现出最高催化活性。荧光实验表明，在添加相应靶标mRNA后，荧光强度显著增加（Bcl-xL约19.8倍，Bcl-xS约15.7倍），而缺乏Mn2+辅因子时无荧光增加。凝胶电泳进一步证实了这些发现，底物条带在Bcl-xL或Bcl-xS mRNA存在下消失。
特异性测试使用三个突变体mRNA，每个在不同位置包含三个错配碱基。完全匹配的Bcl-xL和Bcl-xS靶标产生清晰的底物切割条带，而所有三个错变异构体均未检测到切割片段，证明即使小的序列偏差也会阻止催化激活。检测限（LOD）测定为Bcl-xL mRNA 10.3 pM和Bcl-xS mRNA 13.3 pM，证明了检测系统的高灵敏度。
考虑到脱靶杂交或意外底物水解可能产生假阳性信号，开发了单底物缀合P（1S-P）系统。dPAGE分析显示，只有完整的1S0-P0和1S1-P1对在Bcl-xL存在下产生明显的切割片段，证明双链底物水解能力。
对于SUPER策略，部分酶探针锚定三个底物以确保双"信号开启"输出。电泳实验证实了部分酶-链霉亲和素缀合物的成功合成。组装探针的传感性能通过荧光测定验证，在添加相应靶标mRNA时期望的荧光信号增加，而无靶标时无明显变化。
2.3 用于SUPER递送和DNAzyme催化的MnO2纳米片表征
足够的细胞内金属离子辅因子是DNAzyme介导生物催化的基本前提。为将寡核苷酸探针转入细胞并产生足够的Mn2+离子用于DNAzyme切割反应，首先制备了MnO2纳米片。TEM图像和DLS尺寸分析显示合成的MnO2纳米片直径范围约为100-300 nm。XRD表征显示MnO2的特征衍射峰与标准数据一致。
XPS分析呈现了与Mn 2p1/2、Mn 2p3/2和O 1s相关的特征峰。强烈的UV/Vis吸收进一步证明了成功合成。MnO2/SUPER的zeta电位降低和纳米颗粒尺寸轻微增加表明寡核苷酸探针成功吸附到MnO2纳米片上。
谷胱甘肽（GSH）响应性分解实验显示，随着GSH添加量增加，MnO2纳米片的特征吸收带几乎消失，表明纳米片完全破坏。考虑到癌细胞内部 substantial 的GSH浓度（0.5-10 mM），预计细胞内环境将有效促进MnO2纳米片的完全崩解和后续寡核苷酸探针的释放。
另一方面，8-17 DNAzyme需要至少5 mM Mg2+离子才能有效切割底物，但人体细胞中Mg2+离子浓度较低（0.2-2 mM），不足以进行底物水解。相比之下，8-17 DNAzyme在Mn2+离子存在下获得更高的催化活性，且Mn2+的有效浓度低至1 mM。MnO2分解后激增的Mn2+离子可作为DNAzyme基催化的金属离子辅因子。CCK-8生物相容性评估显示即使在高浓度纳米片下对MCF-7细胞也无明显细胞毒性。
2.4 使用SUPER系统增强细胞内mRNA成像的稳健性和特异性
在体外验证策略后，研究SUPER系统在活细胞中成像Bcl-x mRNA剪接变异体的潜力。选择MCF-7细胞作为模型系统，因其升高的Bcl-xL/Bcl-xS mRNA比率。通过MnO2纳米片作为载体将SUPER系统引入细胞。
裸非自限制P系统研究显示，用常规裸P0和P1探针处理的细胞观察到强烈荧光信号，而用裸P0和P2探针处理的细胞产生弱得多的信号，初步表明MCF-7细胞中Bcl-xL和Bcl-xS mRNA的差异水平。催化核心核苷酸突变的对照探针产生显著较低的荧光，证明靶标重新激活的DNAzyme生物催化对活细胞成像不可或缺。
虽然裸非自限制P检测系统能够分析活细胞中的RNA剪接变异体，但荧光点的随机分布导致靶标mRNA时空信息丢失。我们的SUPER系统具有双原位激活荧光，旨在可视化mRNA变异体的空间分布，同时有效区分和排除非特异性信号。
分别使用1S-P和3S-P系统进行Bcl-xL mRNA的单细胞分析。与1S-P系统相比，3S-P系统触发显著更强的荧光信号，表明生物素-链霉亲和素系统的包含显著放大了荧光强度。详细分析显示，3S-P系统表现出显著更高的共定位系数（约0.75），而1S-P系统为约0.66，表明对Bcl-xL mRNA靶标的识别更准确一致。
对照实验证实，没有MnO2时细胞表现出可忽略的Cy5和FAM荧光，而MnO2存在时观察到强大的双色激活。共定位分析显示SUPER系统产生的信号与溶酶体标记物空间重叠最小，表明大多数信号不局限于溶酶体隔室内。反义序列的负对照实验进一步证实荧光信号确实来源于DNAzyme介导的生物催化反应。
2.5 使用SUPER系统定量分析Bcl-xL和Bcl-xS mRNA剪接变异体
研究SUPER系统同时成像Bcl-xL和Bcl-xS mRNA的可行性，并通过成像不同表达水平的剪接变异体评估检测准确性。Cy5和FAM信号的共定位指示Bcl-xL的真实阳性信号，Cy5和Cy3信号的共定位指示Bcl-xS的真实阳性信号，而独立的信号被视为假阳性信号。
用Bcl-xL模拟物预处理的细胞由于Bcl-xL细胞内丰度升高而表现出增加的Bcl-xL/Bcl-xS比率，而用奥沙利铂预处理的细胞表现出降低的Bcl-xL/Bcl-xS比率，因为奥沙利铂通过增加Bcl-xS转录本的相对丰度来改变Bcl-xL/Bcl-xS mRNA比率。
在对照组中，观察到Bcl-xL mRNA特异性的强烈FAM荧光，且大多数与Cy5共定位。相比之下，Cy3荧光相对较暗，共定位信号在整体Cy5荧光中占小比例。用Bcl-xL mRNA模拟物处理后，Cy5和FAM通道的荧光强度均增加，而Cy3通道无显著变化，表明Bcl-xL模拟物选择性上调Bcl-xL表达而不影响Bcl-xS mRNA水平。奥沙利铂处理时，细胞表现出Bcl-xS转录本相对丰度的显著增加，证据是Cy3信号增加和FAM荧光减少。
相对荧光定量显示，原始FFAM/FCy3比率在控制细胞中计算为1.71，具有高离散度。去除散射噪声后，平均比率降至1.57，数据变异性降低。实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）分析显示，Bcl-xL/Bcl-xS mRNA水平在添加额外Bcl-xL mRNA模拟物后增加15.1%，奥沙利铂预处理导致17.8%减少。
相比之下，共聚焦成像获得的比率变化显示添加Bcl-xL mRNA模拟物后增加40.7%，奥沙利铂处理后增加14.2%。这些比率变化的明显高估可能源于原始数据中固有的信号噪声和模糊性。然而，背景噪声校正后，处理数据揭示更准确的转变：Bcl-xL模拟物处理后增加11.5%，奥沙利铂预处理后减少22.5%。与标准RT-qPCR方法比较，SUPER系统获得更可靠的结果，证实其分析mRNA剪接变异体的优异细胞内准确性。
2.6 使用SUPER系统动态监测AS1411诱导的Bcl-xL mRNA降解
在可靠活细胞成像基础上，通过SUPER策略进一步研究剪接变异体的衰变动力学。AS1411是26核苷酸富鸟嘌呤适体，通过二聚化形成G-四链体结构，对核仁素表现出高结合亲和力。大量研究表明，核仁素选择性识别位于Bcl-xL mRNA 3'-UTR的AU富集元件（AREs），并保护Bcl-xL mRNA免受核酸酶降解。
因此，AS1411可作为分子诱饵，与Bcl-xL mRNA竞争细胞质核仁素结合，降低Bcl-xL mRNA的半衰期。基于这些报告，研究AS1411诱导的加速Bcl-xL mRNA降解。将带有Atto-425荧光团的AS1411预转染到MCF-7细胞中，观察其细胞内分布，然后引入SUPER系统监测Cy5/BHQ2标记的3S-P0和FAM/BHQ1标记的3S-P1随时间的共定位。
在对照组（未预转染Atto-425标记的AS1411）中，Pearson相关系数（PCCCy5-FAM）在t=1小时达到平台期（约0.78）并变得饱和（t=4小时，PCCCy5-FAM=0.77）。相对稳定的共定位表明未经AS1411处理的完整Bcl-xL mRNA转录本，且探针本身不会破坏靶标转录本的稳定性。
预转染Atto-425标记的AS1411的MCF-7细胞成像显示，PCCCy5-FAM最初较高（约0.79），但随时间逐渐下降（t=2小时约0.70，t=3小时约0.66，t=4小时约0.59），表明AS1411加速了Bcl-xL mRNA降解。推测对标本的最小扰动和小探针的快速分子扩散有利于活细胞动态成像。此研究证明SUPER系统检测细胞内剪接mRNA亚型微小偏差的能力，突出其作为原位动态追踪剪接mRNA的稳健工具潜力。
2.7 空间受限SUPER系统激活AS1411用于选择性Bcl-xL mRNA降解
精确的mRNA调控而不干扰其他mRNA转录本一直是临床应用的优选，但由于与类似序列的RNA或RNA结合蛋白的意外相互作用而仍然具有挑战性。这种临床前安全性问题阻碍了这些核酸基药物的临床效用。
在我们的策略中，SUPER系统以高精度在分析物mRNA上构建，位点特异性DNAzyme激活实现局部底物切割。我们探索空间受限催化的SUPER系统是否可调节为敏化天线以原位激活前药并减少非特异性相互作用。由于核仁素被报道结合几种mRNA中的AU富集元件（ARE）除了Bcl-xL外，保护它们免于降解，位点特异性竞争结合核仁素预计可选择性敲低Bcl-xL mRNA。
设计含有底物片段的锁定链（称为阻断剂）与AS1411形成双链结构。其强亲和力将阻碍AS1411的天然折叠及其在Bcl-xL mRNA位点与核仁素的特异性结合。SUPER系统中重建的DNAzyme作为天线，通过切割阻断剂重复解锁局部AS1411。Bcl-xL mRNA附近的这种AS1411激活天线促进与邻近核仁素的竞争性结合以进行后续降解。同时，其他mRNA被阻断剂笼蔽的AS1411包围，防止AS1411-阻断剂与核仁素之间的相互作用；SUPER系统的空间受限催化预计选择性破坏Bcl-xL mRNA。
天然PAGE实验验证了SUPER催化阻断剂切割的可行性。AS1411和阻断剂保持稳定的双链结构。在靶标Bcl-xL协助下，P0和P1可组装成活性DNAzyme结构，催化阻断剂切割，产生降低分子量的切割片段条带。分裂DNAzyme组分（P0、P1和靶标Bcl-xL）与AS1411-阻断剂双链体的混合物导致阻断剂断裂。释放的AS1411条带出现微弱，这与其平行G-四链体结构一致，与线性双链DNA相比，GelRed染色较差。
这些结果证实引入阻断剂可作为分子促进剂锁定AS1411，且重建的DNAzyme可水解阻断剂并释放AS1411。逐步反应监测显示，只有完整的SUPER系统在Bcl-xL mRNA存在下产生强大的时间依赖性荧光增加，表明阻断剂的DNAzyme介导水解和AS1411释放有效。值得注意的是，P0和P1一起但无靶标mRNA时未能激活荧光。这些发现共同证明阻断剂切割仅发生在分裂DNAzyme的两个组分都存在且提供正确mRNA靶标时，突出SUPER介导机制的严格激活要求和高特异性。
为追踪AS1411激活天线诱导的Bcl-xL mRNA衰变动力学，评估FAM和Cy5通道之间相关系数（PCCCy5-FAM）的变化。最初，Cy5和FAM荧光信号之间存在显著重叠，共定位系数达到0.80（t=1小时）；然而，随着孵育时间增加，PCCCy5-FAM逐渐下降（t=2小时约0.76，t=3小时约0.67，t=4小时约0.57）。共定位系数的下降清楚证明Bcl-xL mRNA的降解行为，这意味着AS1411的空间受限激活足以实现Bcl-xL mRNA不稳定化。与此趋势一致，AS1411的荧光恢复显示显著的时间依赖性增加。Atto-425信号从1小时到4小时逐步上升，表明随着SUPER系统切割阻断剂，AS1411从淬灭的AS1411-阻断剂双链体中持续释放。
为评估AS1411激活天线的降解倾向，采用RT-qPCR方法测定报告的核仁素结合mRNA的表达水平，包括生长停滞和DNA损伤诱导基因45α（GADD45α）、白细胞介素2（IL-2）、β-珠蛋白、淀粉样前体蛋白（APP）、胃泌素、CD40配体（CD154）、肾素（REN）和Bcl-xL。SUPER系统单独处理后，三种mRNA（Bcl-xL、APP和GADD45α）的表达水平与对照组相比无显著差异，表明SUPER系统的引入不干扰这三种mRNA的稳定性。由于MCF-7细胞中低表达水平，未检测到其他mRNA，包括IL-2、β-珠蛋白、胃泌素、CD154和REN。
转染AS1411后，所有三种检测到的mRNA均观察到显著减少（Bcl-xL mRNA减少17.2%，APP mRNA减少35.0%，GADD45α mRNA减少50.8%），证实AS1411的竞争性结合导致这些靶标mRNA不稳定化。相反，单独孵育AS1411-阻断剂导致Bcl-xL mRNA表达水平变化最小，符合预期，而APP和GADD45α mRNA水平分别减少12.7%和10.6%。估计APP和GADD45α表达的减少可归因于核仁素对靶标mRNA的差异影响。与单独孵育AS1411-阻断剂的组相比，额外的SUPER基天线系统导致Bcl-xL表达显著减少16.7%。相反，未观察到APP和GADD45α mRNA水平的显著减少。这些结果共同证明AS1411-阻断剂和SUPER系统的整合诱导Bcl-xL mRNA的排他性降解。
为验证AS1411诱导的Bcl-xL mRNA降解是否可推广到MCF-7细胞之外，使用相同的SUPER基天线系统将分析扩展到HeLa细胞。与初步发现一致，SUPER介导的AS1411释放在HeLa细胞中导致Bcl-xL mRNA的选择性减少，而游离AS1411引起核仁素相关转录本的广泛下调，AS1411-阻断剂单独产生最小效应。SUPER-AS1411-阻断剂系统中观察到的无干扰敲低暗示SUPER系统可迅速招募到靶标位点，且重建的敏化天线可有效激活和供应AS1411。
3 结论
受多组分生物组装启发，开发了简单而多功能的SUPER平台，用于无干扰、可靠且高稳健的mRNA剪接成像。单个m
