《Journal of Invertebrate Pathology》：Ascosphaera apis invasion alters the expression pattern, alternative splicing and alternative polyadenylation of transcripts in the eastern honeybee larval gut
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本研究利用纳米孔测序技术分析感染和未感染舞毒蜂幼虫肠道中的差异表达转录本，发现1-3天感染后存在可变剪接（AS）和可变多聚腺苷酸化（APA）事件，并通过RT-qPCR验证部分结果，为理解蜜蜂抗真菌免疫机制提供依据。
邱建峰|王芳吉|李翔|吴涛|景欣|左珍珍|田静|陈大福|郭瑞
福建农林大学蜜蜂科学与生物医学学院，中国福建省福州市350002
摘要
Ascosphaera apis感染蜜蜂幼虫的肠道，导致白垩病，这会影响蜂群的健康和养蜂生产。目前，蜜蜂幼虫抵抗A. apis感染的先天免疫机制尚不清楚。本研究利用纳米孔测序技术分析了A. apis感染和未感染的Apis cerana cerana幼虫肠道中的差异表达转录本（DETs），并发现了蜜蜂基因中的可变剪接（AS）和可变多聚腺苷酸化（APA）现象。结果显示，在感染后1-3天内分别检测到1,642、1,281和1,377个DETs。从每组中随机选取10个DETs进行RT-qPCR验证，其中26个DETs的表达趋势与纳米孔测序结果一致。在感染后1-3天内，共在幼虫肠道中鉴定出2,430个基因的5,476个AS事件，A. apis感染组的AS事件数量高于对照组。另外，还鉴定出7,310个含有APA位点的基因，其中大多数基因具有五个以上的APA位点。这些发现为了解蜜蜂对A. apis感染的转录本水平上的AS和APA作用提供了初步见解。
引言
细胞中的mRNA转录本经历多种共转录和转录后调控过程，包括可变剪接事件（AS）和可变多聚腺苷酸化位点（APA）（Fan等人，2024年；Hedley和Maniatis，1991年）。AS形成的机制包括外显子跳跃、互斥外显子选择、可变剪接位点使用以及内含子保留（Baralle和Giudice，2017年）。APA是指选择不同的多聚腺苷酸化位点并添加poly(A)尾以生成多种转录本异构体的过程（Cheng等人，2020年）。传统的短读长高通量测序在识别AS和APA方面存在固有局限性。相比之下，基于长读长的第三代测序（TGS）在发现新异构体、表征外显子连接以及分析AS和APA方面具有显著优势（Zhang等人，2023年）。TGS现已成为昆虫基因组学中的关键工具，在精确解析AS和APA的多样性和调控机制方面发挥着不可或缺的作用。
AS和APA是驱动蛋白质多样性的关键调控机制，在生长与发育、环境适应、物种分化以及免疫应答等多种生物过程中发挥重要作用。基于纳米孔测序的研究表明，Drosophila胚胎中的AS和APA形成受到基因组相互作用的影响（Zhang等人，2023年）。Drosophila核糖体蛋白S21的剪接或内含子保留可以抑制对Drosophila发育至关重要的磷酸化RNA输出适配器基因的致命突变（Garcia，2022年）。在蜂王和工蜂幼虫中鉴定出许多差异表达的异构体（DEIs），表明poly(A)尾通过负调控DEI表达参与蜂类分化（He等人，2022年）。AS和APA也在蜜蜂的发育和功能转变中发挥作用（Yao等人，2025年）。此外，暴露于寒冷环境的Apis cerana cerana通过AS和APA调节基因表达谱，从而增强越冬期间的抗寒能力（Liu等人，2022年）。
在昆虫中，对真菌病原体的免疫反应涉及保守的Toll信号通路，该通路调节抗菌肽（AMPs）的产生和黑色素化（Valanne等人，2011年；Zeng等人，2019年）。中肠是免疫防御的关键组织（Tleiss等人，2024年）。在真菌感染时，中肠中的模式识别受体（PRR）信号被激活，触发一系列反应，通过分泌AMPs和激活酚氧化酶来抵抗真菌入侵（Cardoso-Jaime和Dimopoulos，2025年；Tleiss等人，2024年）。由真菌病原体Ascosphaera apis引起的白垩病会侵袭蜜蜂幼虫的肠道，导致成年工蜂数量突然减少，给养蜂业造成重大损失。A. apis孢子通过摄入的食物进入蜜蜂幼虫的中肠。在中肠的低氧环境中（1至3天大时），孢子开始萌发——当幼虫进入前蛹阶段（4至6天大时），萌发加速，形成快速增殖的菌丝。这些菌丝延伸并穿透周质膜和肠壁，侵入体腔，在组织中不受控制地扩散。最终，它们从后端突破表皮，逐渐包裹整个幼虫，形成白色的硬质尸体（Hou等人，2023年；Zhao等人，2014年）。尽管白垩病对养蜂业构成严重威胁，但目前尚缺乏有效的抑制方法。最近的研究表明，Bombyx mori和Antheraea pernyi中的AS和APA在应对核多角体病毒（NPV）感染中起作用（Liu等人，2025年；Tang等人，2024年）。然而，中肠中的转录后调控——特别是AS和APA——在蜜蜂对A. apis感染后的抗真菌免疫反应中的作用尚未得到研究。
此前，对A. apis感染和未感染的A. c. cerana幼虫肠道进行的纳米孔测序产生了高质量的全长转录组数据集（Cai等人，2023年；Song等人，2024年）。利用这些数据集，我们比较了两组之间的差异表达转录本（DETs），并识别了幼虫肠道中的可变剪接（AS）和可变多聚腺苷酸化事件（APA）。我们的发现阐明了蜜蜂对A. apis感染的反应及其在转录后水平上的潜在功能，这不仅为蜜蜂抗真菌免疫的分子基础提供了新的见解，也为制定缓解白垩病的策略提供了理论指导。
实验部分
蜜蜂幼虫的饲养和A. apis接种
采用已建立的方法（Chen等人，2020a；Chen等人，2020b）人工饲养A. c. cerana幼虫并接种A. apis>。选择未被A. apis感染的蜜蜂群体（通过PCR确认），并提取含有幼虫的蜂巢。将2天大的幼虫移植到含有50 μL培养基（63%蜂王浆、30%无菌水、6%蜂蜜、1%酵母提取物）的48孔板中，然后在35°C和90%相对湿度下饲养。
A. c. cerana工蜂幼虫肠道对A. apis感染的DET分析
在AcCK1与AcT1组中共鉴定出1642个DETs，其中605个转录本上调，1037个转录本下调（图1A）。AcCK2与AcT2组鉴定出1281个DETs，其中680个转录本上调，601个转录本下调（图1B）。AcCK3与AcT3组共鉴定出1377个DETs，其中1028个转录本上调，349个转录本下调（图1C）。
Venn分析显示有75个共同的DETs。讨论
Ascosphaera apis感染蜜蜂幼虫的肠道会导致成年工蜂数量突然减少，从而对养蜂业造成重大经济损失（Cheng等人，2022年；von Knoblauch等人，2024年）。基于第二代测序技术，已有关于蜜蜂与A. apis相互作用的报道（Chen等人，2020a；Chen等人，2020b；Li等人，2022年）。
未引用的参考文献
Cui和Zhang，2024年；Pardo-Palacios等人，2024年；Shu等人，2022年；Tang等人，2020年；Wu等人，2023年。
CRediT作者贡献声明
邱建峰：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学、研究、数据分析、概念化。
王芳吉：撰写——初稿、方法学、研究、数据分析、概念化。
李翔：方法学、研究、数据分析。
吴涛：研究、数据分析。
景欣：研究、数据分析。
左珍珍：研究、数据分析。
田静：
资助
本研究得到了国家自然科学基金（编号32302817、32372943）、中国农业研究系统专项基金（编号CARS-44-KXJ7）、福建省自然科学基金（编号2025J01616、2023J01447）、福建农林大学硕士导师团队基金（郭瑞）以及福建农林大学科学技术创新基金（编号KFb22060XA）的资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢International Science Editing（http://www.internationalscienceediting.com）对本文的编辑工作。
