首次记录到在中国东南部的茶园中，由球孢白僵菌（Beauveria bassiana）引起的灰柑橘象甲（Sympiezomias citri；鞘翅目：象甲科）的流行病

《Journal of Invertebrate Pathology》：First record of epizootics in the grey citrus weevil ( Sympiezomias citri; Coleoptera: Curculionidae) caused by Beauveria bassiana in tea plantations of Southeast China

灰柑橘象甲在东南茶园暴发真菌流行病，首次自然记录由Beauveria sp.引起。基于Bloc和TEF基因的Bayesian分析及SSR标记，揭示病原菌存在四个亚群，优势亚群II占比78.43%，种群遗传分化指数Gst为0.2697，基因流Nm为0.9427。对8株代表性菌株的毒力、菌落生长、产孢及耐热性评估显示，DH42菌株毒力最强（校正死亡率100%），其特性优于其他菌株。研究证实遗传多样性不直接关联生物防治潜力，需结合表型筛选确定有效菌株，为开发茶树象甲生物农药提供新资源。

　　

王定峰|李良德|李慧玲|李金玉|杨军

福建省农业科学院茶叶研究所，中国福建省福州市

摘要

灰柑橘象甲（GCW）Sympiezomias citri是一种重要的害虫，会对多种经济作物造成严重损害，包括Citrus reticulata、Camellia sinensis和Camellia oleifera。目前主要依赖化学药剂进行控制。然而，利用真菌昆虫病原体进行生物防治是一个重要的替代方案。本研究首次证明了在东南亚的茶园中，多食性灰柑橘象甲（Sympiezomias citri；鞘翅目：象甲科）中发生了由Beauveria属真菌引起的自然流行病。基于遗传多样性与生物防治潜力相关的假设，以及优势遗传谱系在流行病中的主导作用，我们对这种病原真菌进行了研究。通过对核基因间区块区域（Bloc）和翻译延伸因子1-α（TEF）的贝叶斯系统发育分析，发现从受感染的灰柑橘象甲成虫中分离出的51个病原体均为B. bassiana，并且它们被分为四个亚群。简单序列重复（SSR）基因分型显示了显著的遗传多样性及异质性的种群结构，其中一个亚群（第二组，占78.43%）具有明显优势，这支持了在流行期间优势谱系主导的假设。三个种群之间的遗传分化指数（G_st）为0.2697，基因流（N_m）为0.9427，表明这些种群内的基因交流受到限制。为了验证遗传多样性与生物防治潜力之间的关联，我们评估了8个代表性分离株的毒力、菌落生长能力、孢子产生能力和耐热性。然而，结果并未发现遗传分组与毒力或其他关键生物防治特性之间存在强相关性；相反，这些特性表现出明显的菌株特异性。DH42菌株的毒力最强，其校正死亡率为100%，菌落感染率为85.00%，半数致死时间（LT₅₀）为4.76天。DH42菌株还表现出更优的生物特性，如更高的菌丝生长速度、孢子产生率和耐热性。本研究加深了我们对B. bassiana在控制鞘翅目害虫方面潜力的理解，并表明虽然遗传多样性和优势谱系是流行病种群的重要特征，但直接表型筛选对于识别有效的生物防治剂仍然至关重要。高毒力的DH42菌株是开发用于茶园生物防治的真菌杀虫剂的有希望的候选菌株。

引言

灰柑橘象甲（GCW），Sympiezomias citri Chao（鞘翅目：象甲科），是一种高度多食性的害虫，对多种经济作物构成严重威胁，包括Citrus reticulata Blanco、Camellia sinensis（L.）O. Kuntze和Camellia oleifera Abel（Ran, 2015）。成虫以嫩叶、嫩枝和小果实为食，在叶片上造成不规则的切口或孔洞，并对果皮造成不均匀的损害，从而影响作物的产量和品质。目前，大多数地区主要采用化学方法来控制这种象甲。然而，过度使用农药会在农产品中留下有害残留物，对生态系统和人类健康构成威胁。因此，探索可持续的替代控制方法已成为当务之急。

真菌昆虫病原体作为环保的生物防治剂，在自然界中广泛存在，被认为是综合害虫管理计划中的关键组成部分。Beauveria属的物种已被广泛用于控制农业和森林害虫（Feng et al., 1994, Zimmermann, 2007, de Faria and Wraight, 2007, Li et al., 2010, Rehner et al., 2011）。尽管在实验室条件下，GCW对B. bassiana和B. brongniartii等昆虫病原真菌敏感（Wang et al., 2014, Wang et al., 2018），但尚未开发出针对GCW的Beauveria基真菌杀虫剂，关于Beauveria在这种象甲中的感染情况也知之甚少。虽然有报道指出Beauveria等真菌病原体在某些害虫种群中引发了自然流行病（例如Luan et al., 2011中的螳螂种群、Mascarin et al., 2017中的Ocola跳甲以及Luan et al., 2013中的中国穴居虫），但迄今为止尚未有GCW中的自然流行病记录。然而，在2012年夏季，中国东南部的一个茶园中观察到了由Beauveria属真菌引起的显著流行病。这些Beauveria菌株为GCW的生物防治提供了宝贵的资源。

为了有效研究和利用在自然条件下收集的Beauveria菌株，确定其分类地位和系统发育关系至关重要。传统的基于形态特征的Beauveria鉴定方法受到限制，因为该属内物种之间的表型特征缺乏明显差异（Rehner et al., 2011, Imoulan et al., 2017）。分子系统发育分析揭示了Beauveria属内存在许多隐存物种，包括B. bassiana、B. brongniartii、B. lii、B. hoplocheli、B. medogensis和B. araneola（Rehner et al., 2011, Zhang et al., 2012, Robène-Soustrade et al., 2015, Imoulan et al., 2016, Chen et al., 2017）。基于核核糖体内部转录间隔区（ITS）（Rehner and Buckley, 2005）、Bloc核基因间区域（Rehner and Buckley, 2005, Rehner et al., 2006, Imoulan et al., 2016）、RNA聚合酶II亚基（RPB1和RPB2）（Rehner et al., 2011, Imoulan et al., 2016）以及翻译延伸因子-1α（TEF）（Rehner et al., 2006, Rehner et al., 2011, Meyling et al., 2012, Imoulan et al., 2016）的多基因序列分析有助于鉴定Beauveria物种并进行系统发育分析。此外，微卫星标记（SSR）已成功应用于评估不同生态系统中的Beauveria种群遗传学（Meyling et al., 2009, Meyling et al., 2012, Pérez-González et al., 2014, Serna-Domínguez et al., 2019）。

关于Beauveria等真菌昆虫病原体的遗传多样性与生物防治潜力之间的关系仍是研究的热点。一些研究表明特定遗传群可能与对某些昆虫宿主的毒力相关（Maurer et al., 1997; Santoro et al., 2008, Chen et al., 2015），而另一些研究则未发现明显相关性，强调栖息地而非宿主物种是种群结构的主要决定因素（Bidochka et al., 2002, Johny et al., 2012, Castrillo et al., 2010）。此外，对真菌流行病的研究发现了一个有趣且反复出现的模式：在流行期间常出现优势遗传谱系。这一观察结果提出了这样的假设：这些优势谱系可能在推动疾病快速传播、引发流行病方面起关键作用，而共存的其他次要谱系则以较低频率存在，可能有助于病原体在宿主种群中的长期存在（Luan et al., 2011, Luan et al., 2013, Zhang et al., 2016）。然而，这一假设尚未得到最终验证，因为长期生态数据集将谱系优势与流行动态联系起来的研究仍然不足。

这次GCW的自然流行病事件为我们提供了一个独特的机会，以评估遗传多样性与流行病种群中的生物防治潜力之间的关联，并确定其他系统中观察到的谱系优势模式是否也在此出现。我们假设该种群内的显著遗传多样性会表现为关键生物防治特性（如毒力、分生孢子产生能力和环境耐受性）的菌株特异性差异。验证这一假设至关重要，因为强烈的基因型-表型关联可以通过分子筛选帮助选择有效的生物防治剂。相反，如果不存在这种关联，则强调了直接表型评估每个候选菌株的重要性。

因此，在本研究中，我们采用了一种综合方法，结合分子技术和表型分析来（1）确定参与GCW流行病的Beauveria病原体的分类地位和遗传多样性；（2）通过明确测试遗传多样性是否影响毒力和其他关键生物防治特性来评估其生物防治潜力。通过对两个基因组DNA区域（Bloc和TEF）的部分序列进行系统发育分析，对51个GCW分离株进行了分类。进一步使用SSR标记评估了这些分离株的遗传多样性和种群异质性。为了选择合适的生物防治剂，选择了代表不同亚群的8个分离株，对其针对成年GCW的毒力以及菌落生长速度、分生孢子产量、萌发能力和耐热性等生物特性进行了测试。

部分内容

流行病地点和真菌分离株

在中国东南部的一个茶园（1667.5平方米）（地点A，坐标113°38′42″E, 24°30′33″N）意外发现了一场由真菌病原体引起的GCW流行病。在地点A，观察到大量受感染的虫尸，因此沿茶园对角线进行了系统采样以确保全面的空间覆盖。2012年8月10日，共收集到40个自然木乃伊化的GCW虫尸，这些虫尸显示出明显的真菌感染迹象（图1）

系统发育分析

基于ITS区域的初步鉴定确认所有51个GCW分离株与B. bassiana参考序列（例如MT528673、JQ320361和HQ444271）具有高度同源性（≥99%）。然而，由于ITS区域在该物种内的变异较小，不适合用于解析更精细的系统发育关系。因此，我们转而使用变异较大的Bloc和TEF标记进行系统发育分析。

根据多序列比对（MSA）的结果

讨论

Beauveria bassiana是一种具有广泛生态功能的全球性空气传播昆虫病原真菌（Bamisile et al., 2018），宿主范围也很广（Li, 1988）。作为天敌，B. bassiana会在昆虫种群中引发广泛的流行病。Luan et al.（2011）报道了中国东部螳螂种群中由B. bassiana引起的自然流行病，此外在松毛虫（Dendrolimus spp.）种群中也观察到了由B. bassiana引发的几次流行病

未引用的参考文献

Hajek and Leger (2003)

CRediT作者贡献声明

王定峰：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，监督，项目管理，方法学，资金获取，数据管理，概念构思。李良德：撰写 – 原稿，调查，正式分析。李慧玲：撰写 – 原稿，调查，正式分析，数据管理。李金玉：撰写 – 审稿与编辑，软件应用。杨军：软件应用，数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们非常感谢李建龙博士在甲虫采集方面的协助，以及常云妮博士在逻辑回归分析中的技术支持。同时，我们也衷心感谢林佳博士对早期草稿提供的宝贵意见。本工作得到了中国福建省科学技术厅项目的资助（项目编号2019R1029-4, 2023R1088）以及福建省科学院的“百人”青年科学精英计划的支持