《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：DPP4-regulated endothelial cell ferroptosis modulates atherosclerosis progression by ferritinophagy
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动脉粥样硬化（AS）早期内皮细胞铁死亡（ferroptosis）机制研究。通过临床样本分析发现严重冠心病患者血浆DPP4水平显著升高，动物实验证实DPP4缺陷小鼠AS进展减缓，机制为DPP4通过NCOA4介导的ferritinophagy促进脂质过氧化及铁死亡，抑制DPP4可保护内皮功能并延缓AS早期进程。
郑兰卓|梁珂|彭圆圆|金梦颖|陈晓|刘欣然|邵华|张涛|段家伟|严菲菲|魏宝珠|万静
武汉大学中南医院心脏病科，心肌损伤与修复研究所，中国武汉430071
摘要
背景
动脉粥样硬化（AS）是冠状动脉疾病（CAD）的主要病理生理基础，其发病始于内皮功能障碍，这促进了脂质沉积和斑块形成。新兴证据表明二肽基肽酶IV（DPP4）与血管病理有关，但其在AS相关内皮铁死亡（ferroptosis）中的作用机制尚未明确。
方法
采用了多学科方法：1）通过生物信息学分析公共数据库，确定了DPP4与铁死亡及AS之间的关联；2）测量不同CAD严重程度患者血浆中的DPP4水平；3）在高脂饮食条件下，比较了DPP4?/?ApoE?/?和ApoE?/?小鼠的动脉粥样硬化进展；4）利用蛋白质组学、环己亚胺追踪实验和自噬药物调控方法，研究了ox-LDL诱导的内皮损伤模型中的DPP4介导的铁死亡机制。
结果
临床样本分析显示，严重冠状动脉狭窄患者的血浆DPP4水平显著升高，并且在斑块中观察到DPP4的富集。动物实验表明，DPP4缺乏可减缓小鼠模型中的AS进展和铁死亡。细胞实验发现，ox-LDL会上调DPP4表达，同时增加铁死亡敏感性和内皮功能障碍。DPP4抑制通过阻断脂质过氧化物积累来保护内皮细胞存活。机制研究表明，DPP4与AS中的铁死亡和自噬途径相关。DPP4通过NCOA4介导的铁蛋白吞噬作用（ferritinophagy）破坏FTH1，这一点通过氯喹（自噬抑制剂）和沙格列汀（DPP4抑制剂）对FTH1的保护作用得到证实。
结论
本研究证实内皮DPP4是铁蛋白吞噬驱动的铁死亡过程的调节因子，可导致AS中的内皮功能障碍。我们的发现提出，针对DPP4-NCOA4-FTH1轴可能是保护内皮细胞存活和阻止AS早期进展的有效策略，这对DPP4抑制剂在心血管治疗中的重新应用具有临床意义。
引言
动脉粥样硬化（AS）是多种心血管和脑血管疾病的主要病理生理基础，包括冠状动脉疾病（CAD）、心肌梗死和中风。它是一个由多种因素调控的复杂病理过程。内皮细胞被视为保护血管的第一道防线。在动脉粥样硬化的初期阶段，血液中的有害物质会损伤内皮，导致内皮通透性增加、松弛能力下降和炎症反应。随后，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）在内皮下积聚，促使血管细胞粘附分子（如VCAM-1和ICAM-1）的表达和释放。这些分子促进淋巴细胞和单核细胞从血液进入内皮下空间，最终在多种因素作用下形成斑块[1][2]。因此，内皮细胞功能障碍可以被视为动脉粥样硬化的起始因素。进一步探索内皮细胞功能障碍的病理生理机制对于预防和治疗心血管疾病至关重要。
二肽基肽酶IV（DPP4）是一种具有丝氨酸蛋白酶活性的膜结合酶，通过切割循环肽来调节多种生理过程。其底物包括胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、GLP-2和基质细胞衍生因子-1（SDF-1）等。DPP4抑制剂被广泛用作抗糖尿病药物，因为它们通过抑制GLP-1的降解来降低餐后血糖水平。此外，临床观察表明DPP4抑制剂还具有心血管保护作用[3][4]。研究表明，与对照组相比，不稳定型心绞痛和稳定型慢性冠状动脉疾病患者的血浆中可溶性DPP4（sDPP4）水平显著升高[5]。与磺脲类药物相比，DPP4抑制剂与不良心血管事件的发生率降低相关[6]。DPP4的抗动脉粥样硬化作用主要归因于其降低血脂、抑制炎症和促进血管扩张的能力[3]。在内皮细胞中，DPP4抑制剂（如沙格列汀）可通过非GLP-1途径上调内皮一氧化氮合酶（eNOS）[7][8]，增加一氧化氮（NO）水平或通过调节AP-1来改善内皮功能障碍[9]，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。尽管现有的利用DPP4抑制剂（西格列汀、沙格列汀）的动脉粥样硬化模型研究显示出了治疗效果，但关于DPP4促动脉粥样硬化作用的遗传决定因素、斑块中膜蛋白DPP4的表达和定位以及调节内皮细胞功能的具体机制仍存在未解之谜。
在动脉粥样硬化斑块中，内皮细胞会经历多种程序性死亡[10][11]。铁死亡是一种新发现的程序性死亡形式，不同于凋亡、坏死性和焦亡。其特征是细胞内铁的积累，导致芬顿反应（Fenton Reaction）和细胞内脂质过氧化物的增加，最终导致细胞死亡[12]。铁蛋白由铁蛋白轻链1（FTL1）和铁蛋白重链1（FTH1）组成，通过结合细胞内铁来储存铁。另一方面，NCOA4作为自噬货物受体，通过与铁蛋白和MAPLC3/LC3结合来介导铁蛋白的自噬降解（即铁蛋白吞噬作用），补充细胞内的不稳定铁池（LIP）。当自噬过度时，细胞内铁含量增加，引发芬顿反应，导致脂质过氧化[13][14]。此外，系统Xc-（包括溶质转运蛋白家族7成员11（SLC7A11）和SLC3A2）将半胱氨酸导入细胞。在细胞内，半胱氨酸被还原为巯基丙氨酸（cysteine），用于合成谷胱甘肽（GSH），这是主要的细胞抗氧化剂。GSH通过谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）缓解脂质过氧化，从而防止铁死亡[15]。最近的研究强调了铁死亡在心血管疾病中的重要作用。动脉粥样硬化（AS）病变中的铁含量高于正常血管。铁蛋白吞噬作用会加剧血管内皮的铁死亡和损伤[16]。铁死亡抑制剂Fer-1已被证明可以降低血管内皮细胞中的铁含量和脂质过氧化程度，恢复内皮功能，并最终减轻AS病变的严重性[17]。暴露于氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的主动脉内皮细胞中，SLC7A11和GPX4的表达减少[18][19][20]。SLC3A2蛋白的降解可诱导内皮细胞中的铁死亡并加重斑块进展[21]。这表明血管内皮细胞中的铁死亡与内皮功能障碍和AS病变密切相关。此外，最近的研究将DPP4确定为与铁死亡相关的基因，并将其纳入肿瘤预后的铁死亡相关基因表达模型中[22][23]。在TP53?/?肿瘤细胞中，膜DPP4与NOX1的相互作用会增强脂质过氧化并诱导铁死亡[24]。然而，DPP4与动脉粥样硬化背景下内皮细胞铁死亡的具体关系仍需进一步阐明。
在本研究中，我们创新性地使用了DPP4?/?ApoE?/?小鼠来探讨DPP4在动脉粥样硬化中的作用。我们的发现表明，在经典的动脉粥样硬化模型（特别是高脂饮食喂养的ApoE?/?小鼠）中，DPP4表达显著升高并定位于内皮细胞内。DPP4基因的缺乏显著减少了斑块负荷和斑块内的铁死亡。基于这些观察，我们假设动脉粥样硬化斑块中的受损内皮细胞表现出DPP4表达上调，这会诱导铁死亡并最终促进斑块形成。在机制研究方面，我们发现DPP4主要通过促进铁蛋白吞噬作用来触发铁死亡并加剧内皮细胞功能障碍。
试剂和抗体
使用的抗体包括：抗β-actin（GB15003–100，Servicebio，中国），抗GAPDH（60004–1-Ig，Proteintech，美国），抗SLC7A11（12,691，Cell Signaling Technology，美国），抗GPX4（ab125066，Abcam，英国），抗FTH1（4393，Cell Signaling Technology，美国），抗ICAM-1（A5597，ABclonal，中国），抗VCAM-1（A23692，ABclonal，中国），抗eNOS（A20985，ABclonal，中国），抗DPP4（ab215711，Abcam，英国），抗DPP4（68383–1-Ig，Proteintech，美国），抗CD31（66065–2-Ig，Proteintech，美国）
动脉粥样硬化中DPP4表达升高，最初出现在内皮细胞中
我们之前的研究结果初步表明DPP4是与动脉粥样硬化和铁死亡相关的基因[29]。为了进一步验证这一点，我们分析了已发表的转录组数据（GSE43292）[30]，发现人类颈动脉粥样硬化样本中的DPP4 mRNA表达显著高于正常样本（图1A）。从CAD患者中收集血浆，并测量了血浆中的sDPP4水平。根据结果对CAD的严重程度进行了分类
结论与讨论
我们的研究表明，内皮细胞铁死亡是内皮功能障碍的一种新表现形式，并确定DPP4是动脉粥样硬化的遗传风险因素。在病理条件下，受损内皮细胞中的DPP4表达升高。上调的DPP4通过增强自噬通量来促进NCOA4介导的铁蛋白吞噬作用，从而增加LIP并触发铁死亡。在铁死亡过程中，脂质过氧化物的积累会导致
CRediT作者贡献声明
郑兰卓：撰写 – 原始草稿，可视化，方法学，数据管理，正式分析，研究。梁珂：研究，验证。彭圆圆：撰写 – 审稿与编辑，正式分析，项目管理，监督。金梦颖：方法学，概念化。陈晓：研究。刘欣然：验证。邵华：资金获取。张涛：撰写 – 审稿与编辑。段家伟：撰写 – 审稿与编辑。严菲菲：数据管理
伦理批准和参与同意
所有描述的人类实验均符合国家指南，并获得了武汉大学中南医院医学伦理委员会的批准（批准编号：2021095?K）。
动物实验按照《实验动物护理和使用指南》进行，并得到了武汉大学中南医院实验动物福利和伦理委员会的同意（批准编号：ZN2023188）。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
作者在撰写本手稿时未使用生成式AI或AI辅助技术。
利益冲突声明
作者声明他们没有可能影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢所有匿名审稿人和编辑的宝贵意见，这些意见显著提升了手稿的质量。
本研究得到了湖北省自然科学基金（资助编号）、武汉大学中南医院重点项目基金（资助编号PTXM2023006）以及中国心脏病学会CSC临床研究专项基金2023年B类项目（资助编号CSCF2023B01）的支持。
