《Journal of Molecular Structure》：Scaffold Hopping Strategy Toward Novel Pyrazolo[3,4-
d]pyrimidine-Based Thiazole Frameworks as Potential Cholinesterase Inhibitors for Treating Alzheimer’s Disease: Insight into In Vitro and In Silico Approaches
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阿尔茨海默病治疗药物开发：合成Pyrazolo[3,4-d]pyrimidine衍生物并评估其抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）活性，发现12b双效抑制活性最佳（AChE IC50=0.61±0.10 μM，BuChE IC50=1.90±1.10 μM），优于多奈哌齐，SAR分析及分子对接验证结构-活性关系，DFT和ADME优化药代性质。
Fakhria A. Al-Joufi|Maher S. Alwethaynani|Hina Sarfraz|Faisal Asif|Rafaqat Hussain|Asma Sardar|Yousaf Khan|Fakhrul Hassan|Ammena Y Binsaleh|Nawal Al-Hoshani|Reem Nabil Hassan|Mariam Ameen Mojally
沙特阿拉伯朱夫大学药学院药理学系，72341 Aljouf
摘要
我们合成并表征了一系列基于吡唑[3,4-d]嘧啶的噻唑衍生物9a-g和12a-e，采用了一氢核磁共振（1H NMR）、十三碳核磁共振（13C NMR）和质谱分析技术。这些化合物被用于评估其对乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）的抑制活性，以探讨其在阿尔茨海默病治疗中的潜在作用。大多数衍生物表现出显著的抑制效果，其中化合物12b的双重抑制活性最强（AChE的IC??为0.61 ± 0.10 μM，BuChE的IC??为1.90 ± 1.10 μM），优于常用的多奈哌齐药物。结构-活性关系（SAR）分析表明，苯环上供电子的（-OH）和吸电子的（-CF?）取代基显著影响了其生物活性。分子对接研究通过显示活性位点内的强氢键和疏水相互作用进一步支持了这些结果。我们还进行了密度泛函理论（DFT）和药物代谢动力学（ADME）研究，以优化化合物的设计和药代动力学特性。DFT计算揭示了电子结构、稳定性和反应性，有助于预测结合亲和力和靶点选择性。ADME研究评估了关键的药代动力学参数，包括溶解度、渗透性和代谢稳定性，确保这些化合物具有良好的药物特性。综上所述，基于吡唑[3,4-d]嘧啶的噻唑衍生物为开发治疗阿尔茨海默病的新酶抑制剂提供了有前景的骨架。
引言
阿尔茨海默病（AD）是成人神经退行性疾病的主要原因。这是一种慢性、进行性和不可逆的疾病，其特征是认知能力下降、记忆丧失和行为障碍。该疾病在全球范围内对公共卫生和社会经济造成了日益严重的负担，特别是在发展中国家[1,2]。根据2021年世界阿尔茨海默病报告，预计到2050年，全球AD病例数将从3500万增加到1.35亿[3]。AD的复杂多因素病理机制包括β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的积累、由过度磷酸化的tau蛋白形成的神经纤维缠结（NFTs）、N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）过度激活导致的突触功能障碍以及乙酰胆碱水平降低、活性氧（ROS）引发的慢性神经炎症和CREB依赖性基因转录受损[4],[5],[6],[7],[8]。目前获批的FDA药物如乙酰胆碱酯酶抑制剂（多奈哌齐和利凡斯的明）和NMDAR拮抗剂（美金刚）仅能缓解症状，无法阻止或逆转疾病进展[9]。这些传统药物主要作用于特定的酶靶点（如胆碱酯酶），但常常带来代谢不稳定、药物相互作用、难以维持最佳血浆浓度以及制剂相关限制等临床问题[10]。传统的单一靶点药物设计模式常常伴随显著的副作用和高治疗失败风险。因此，研究越来越多地集中在多靶点导向配体（MTDLs）的设计上，以更有效地应对AD的复杂多因素性质[11,12]。这种策略旨在创建能够同时调节多种病理机制的单个分子实体[13,14]。在AD的病理过程中，AChE和BuChE都起着促进聚集的非催化作用，它们通过与β-淀粉样蛋白（Aβ）的相互作用促进斑块的形成和发展。因此，开发同时具有胆碱酯酶抑制和抗氧化活性的化合物成为缓解阿尔茨海默病认知衰退的有前景的治疗策略[15,16]。
文献研究表明，具有不同取代模式和生物应用的小分子骨架为理解分子结构与性质之间的关系提供了有用的见解[17,18]。作为DNA和RNA的关键组成部分，嘧啶具有多样的药理活性。嘧啶衍生物从核酸水解物中分离出来，其碱性强于吡啶，并且具有较高的水溶性[19]。嘧啶及其衍生物表现出广泛的生物活性，包括抗病毒[20]、抗癌[21]、抗炎[22]、抗菌[23]、抗氧化[24]、抗炎和镇痛[25]作用。
在我们之前的工作中，我们合成了一系列含有噻唑结构的化合物，这些化合物对阿尔茨海默病表现出良好的活性。本研究揭示了影响活性的结构特征[26]。总体而言，这些文献调查表明，阿尔茨海默病是一种复杂的多因素疾病，治疗策略包括合理设计的胆碱酯酶抑制剂、通过神经营养信号通路减轻神经炎症和认知障碍、通过肠道-大脑-微生物群轴调节疾病进展以及开发选择性受体激动剂等精准治疗策略[27],[28],[29],[30],[31]。吡唑[3,4-d]嘧啶是一种被广泛认可且多功能的结构骨架，常用于药物设计[32,33]。作为我们持续开发具有增强效力、良好安全性特征和优良药物特性的新型阿尔茨海默病抑制剂的一部分，我们通过骨架跳跃策略合成了一系列含有噻唑结构的吡唑[3,4-d]嘧啶衍生物（见图1）。在此设计中，我们保留了咪唑氮上的三甲氧基苯基团以保持其抗阿尔茨海默病活性，并研究了咪唑环结构修饰对其抗阿尔茨海默病效果的影响。为此，我们引入了多种取代基以优化化合物9b的性能，该化合物是通过结构-活性关系（SAR）研究确定的。我们评估了这些化合物的抗阿尔茨海默病活性，并阐明了其作用机制和直接分子靶点。这一工作偶然发现了化合物9b，这是一种新型的双靶点抑制剂，能够同时抑制AChE和BuChE，具有高效力、改善的溶解性和良好的代谢稳定性。
化学合成
化学合成
目标化合物9a-9g是通过多步骤反应获得的。首先，将硫脲1与2-溴-1-(3-甲氧基苯基)乙烷-1-酮和三甲胺在乙醇中反应，得到4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-胺中间体3。另一方面，中间体8a-8g是通过三步反应获得的。3,4,5-三甲氧苯胺4与SnCl?和NaNO?反应，并加入37%的HCl，得到(3,4,5-三甲氧苯基)肼5。
材料与方法
所有试剂和溶剂均购自商业渠道。反应进程通过TLC板在254 nm紫外光下进行监测。产物纯化通过重结晶或硅胶柱色谱法实现。目标化合物的结构通过NMR光谱（1H和13C）和HRMS确认。NMR光谱在600 MHz（1H NMR）和150 MHz（13C NMR）光谱仪上记录，使用DMSO-d?作为溶剂。HRMS分析在AB 5600+ Q-TOF上进行。
结论
我们成功合成了一系列基于吡唑[3,4-d]嘧啶的噻唑衍生物，并评估了它们作为乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）抑制剂的潜力。生物筛选显示化合物12b的抑制效果最强，超过了标准药物多奈哌齐。结构-活性关系（SAR）分析强调了供电子和吸电子取代基对抑制潜力的积极影响。
CRediT作者贡献声明
Fakhria A. Al-Joufi：撰写初稿、方法学研究、数据分析、正式分析。
Maher S. Alwethaynani：方法学研究、数据分析、正式分析。
Hina Sarfraz：撰写初稿、方法学研究、正式分析。
Faisal Asif：正式分析、数据管理。
Rafaqat Hussain：撰写、编辑、监督、资源管理、项目协调、概念构思。
Asma Sardar：方法学研究、数据分析、正式分析。
Yousaf Khan：软件应用、数据分析。
致谢
本研究得到了沙特阿拉伯利雅得Nourah bint Abdulrahman大学研究支持项目（PNURSP2026R419）的支持。
