来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的甘油酸氧化体柠檬酸合成酶3的晶体结构揭示了一种新的寡聚状态

《Journal of Structural Biology》：Crystal structure of glyoxysomal citrate synthase 3 from Arabidopsis thaliana reveals a novel oligomeric state

植物柠檬酸合酶Arabidopsis thaliana CSY3的晶体结构研究揭示其形成同源四聚体，不同于大肠杆菌六聚体和凤梨八聚体，通过氢键和疏水作用介导，并验证了溶液中存在四聚体形式。

　　

西尾和也（Kazuya Nishio）| 高木健二（Kenji Takagi）| 水岛恒弘（Tsunehiro Mizushima）

兵库大学研究生院理学部科学系，日本姬路市Shosha 2167，邮编671-2280

摘要

柠檬酸合成酶（CS）是碳水化合物和能量代谢中的关键酶，在包括线粒体和植物中的乙醛酸体在内的多种真核细胞器中存在不同的亚型。尽管CS表现出多种寡聚状态，但关于高等植物非线粒体II型CS的详细结构信息仍然有限。本文测定了拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的CS 3与草酰乙酸（OAA）和乙酰辅酶A（CoA）-OAA复合物的晶体结构，分辨率分别为2.0 ?和1.7 ?。这些结构显示，AtCSY3可以形成同源四聚体，这与大肠杆菌（Escherichia coli）的六聚体和菠萝（Ananas comosus）的八聚体不同。晶体结构中观察到的四聚体排列是由亚基之间的氢键和疏水相互作用介导的。凝胶过滤色谱进一步表明，在纯化条件下溶液中也存在四聚体形式。在四聚体结构中，两个二聚体之间的界面附近观察到了配体密度；然而，目前尚无实验证据表明配体结合是否会影响AtCSY3的寡聚状态或酶活性。这些结构展示了CS寡聚化的结构多样性，并为研究植物乙醛酸体中的CS提供了结构基础。

引言

柠檬酸合成酶（CS）催化三羧酸（TCA）循环和乙醛酸循环中的第一个反应，即草酰乙酸（OAA）和乙酰辅酶A（CoA）转化为柠檬酸和CoA（Remington, 1992; Wiegand and Remington, 1986）。在植物和一些真核微生物中，线粒体中的TCA循环和乙醛酸体中的相关乙醛酸循环是细胞能量代谢中的核心途径。这两个细胞器含有催化这些相关反应的异构酶，尽管CS的整体反应具有保守性，但这些异构酶表现出不同的特性，如免疫学行为和对抑制剂的敏感性。在蓖麻豆（castor bean）的CS中，线粒体CS对5,5′-二硫代-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）不敏感，而乙醛酸体CS对DTNB高度敏感（Schnarrenberger C., 1980），尤其是在没有OAA的情况下，它会迅速且完全失活。CS在其寡聚状态和调控机制上也表现出显著的多样性（Schnarrenberger & Martin, 2002）。

在植物中，乙醛酸循环在种子快速萌发过程中利用脂质作为能量来源方面起着重要作用。拟南芥（Arabidopsis thaliana）编码五种CS（Heazlewood et al., 2004; Pracharoenwattana et al., 2005; Nishio and Mizushima, 2020），其中三种（AtCSY1、AtCSY2和AtCSY3）定位于乙醛酸体中。AtCSY2和AtCSY3在整个幼苗生长过程中都表达。乙醛酸体中的CS不仅是乙醛酸循环的关键酶，还催化脂肪酸呼吸作用中的重要步骤（Pracharoenwattana et al., 2005）。乙醛酸体中的CS对于从三酰甘油中β-氧化脂肪酸是必需的。CS在大多数生物体中都是高度保守的酶，并且存在两种不同的结构类型。真核生物、革兰氏阳性细菌和古菌中的I型酶形成同源二聚体，而革兰氏阴性细菌中的II型酶是具有额外N端区域的六聚体（Nguyen et al., 2001）。植物乙醛酸体中的CS更类似于II型酶。然而，在Mg²⁺存在下，蓖麻豆种子中的乙醛酸体CS会形成四聚体（Zehler, 1984），而陆地植物菠萝（Ananas comosus）中的酶主要是八聚体（Sendker, Schlotthauer et al., 2024）。此外，大肠杆菌（Escherichia coli）中的CS（EcCS）根据盐浓度的不同可以呈现二聚体、四聚体或六聚体状态（Stokell et al., 2003），Synechocystis elongatus中的CS的冷冻电镜结构则组装成十八聚体复合物和其他更高阶的寡聚体（Sendker et al., 2024a, Sendker et al., 2024b）。最近的研究强调了这一酶家族内自组装的显著多样性，表明代谢酶可以通过多种寡聚状态进化（Sendker et al., 2024b, Sendker et al., 2024a）。

I型和II型CS的晶体结构已经确定，包括未结合配体的酶和底物/类似物复合物（Stokell et al., 2003; Nishio and Mizushima, 2020; Nguyen et al., 2001; Remington et al., 1982）。大肠杆菌中的六聚体II型CS由三个相同的二聚体单元组成，NADH结合位点位于二聚体单元之间的界面（Maurus et al., 2003; Stokell et al., 2003）。尽管植物CS亚型，特别是非线粒体中的II型CS在功能上非常重要，但关于它们的结构信息比细菌和动物的对应物要少。为了研究高等植物中CS的结构特性，我们测定了拟南芥（A. thaliana）中的CSY3与OAA（AtCSY3-OAA）、CoA与OAA（AtCSY3-CoA-OAA）以及OAA与5-巯基-2-硝基苯甲酸（MNB）（AtCSY3-MNB-OAA）复合物的晶体结构，分辨率分别为2.0 ?、1.7 ?和2.3 ?。我们的结构提供了植物CS的寡聚结构信息。

AtCSY3的总体结构

AtCSY3-OAA的晶体结构在1.95 ?的分辨率下得到确定（图1A）。AtCSY3-OAA的晶体学不对称单元包含四个单体，它们形成了一个由两个二聚体单元（AB和CD）围绕二重轴排列的同源四聚体（图1A）。AtCSY3-OAA的单体结构几乎相同，亚基A-D之间的等效Cα原子的均方根偏差范围为0.316–0.851 ?。AtCSY3的单体结构采用了

蛋白质表达和纯化

用于在大肠杆菌（E. coli）中表达的、经过密码子优化的拟南芥（Arabidopsis thaliana）CSY3（AtCSY3）由GeneArt（ThermoFisher）设计，合成的DNA使用BamHI和SalI限制性内切酶克隆到pMALp2X载体中。AtCSY3的N端序列（1–35个残基）被去除。用于去除MBP标签的Xa切割位点被替换为HRV 3C蛋白酶的切割位点。重组AtCSY3在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达。AtCSY3被纯化

作者贡献

KN进行了实验并分析了数据。KT参与了数据分析。TM设计了实验、分析了数据并撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。

未引用参考文献

Madeira et al., 2024; McNicholas et al., 2011; Robert and Gouet, 2014.

CRediT作者贡献声明

西尾和也（Kazuya Nishio）： 实验研究、数据管理。高木健二（Kenji Takagi）： 数据管理。水岛恒弘（Tsunehiro Mizushima）： 初稿撰写、实验设计、数据分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS KAKENHI）的资助，项目编号为24K01968（资助对象为T.M.）。本研究使用了位于日本大阪大学SPring-8的同步辐射光束线BL44XU，在日本Harima的SPring-8的蛋白质研究所合作研究计划下进行。衍射数据是在大阪大学BL44XU光束线上收集的，提案编号分别为2018A6849、2018B6849、2019A6949、2019B6949、2020A6549、2021A6640、2021B6640、2022A6735、2022B6735、2023A6835、2023B6835。